Análisis de los niveles de expresión de diferentes proteasas en hojas senescentes de cebada (Hordeum vulgare L.).

VELIZ C.G.; CAPUTO C.; CRIADO M.V.; ROBERTS I.N.

Congreso; 4to Congreso Latinoamericano de cebada.; 2013

La degradación de proteínas en los órganos vegetativos durante la etapa de senescencia es una condición necesaria para la efectiva removilización del nitrógeno (N) hacia las nuevas hojas o granos en desarrollo. En cebada todavía es muy poco lo que se conoce sobre las proteasas específicas de la etapa de senescencia. El objetivo de este trabajo fue analizar la expresión de seis proteasas (SAG12, PAP, CND41, SUBT, CPMIII y LeuAP) seleccionadas a partir de la bibliografía durante la senescencia foliar natural o inducida en plantas de cebada por RT-PCR. Las plantas se cultivaron en cámara de crecimiento, invernáculo o a campo. En el ensayo en cámara se trabajó con plantas de 15 d induciendo la senescencia con metil jasmonato (MJ) 200 μM o por incubación en oscuridad. En el ensayo de invernáculo se muestrearon hojas no senescentes y senescentes de plantas de 125 d, mientras que las muestras de campo se tomaron de un cultivo de cebada de la localidad de Junín a los 112 (muestreo 1) y 138 (muestreo 2) días después de la siembra. Los niveles de ARN mensajero de las proteasas y de dos genes housekeeping (actina y TEF1α) se determinaron por RT-PCR semi-cuantitativa o qRT-PCR en tiempo real. En el primer caso la intensidad de las bandas se cuantificó usando el software ImageJ. En ambos casos, se consideró inducción de un gen cuando se midieron niveles de expresión de 1,5 veces o más respecto del control de cada ensayo y se consideró como represión niveles de expresión de 0,5 veces o menos también respecto del control. En el ensayo de cámara, la incubación en oscuridad (tanto en hoja cortada como en planta entera) condujo a la inducción de SAG12, PAP, SUBT y CPMIII mientras que el tratamiento con MJ incremento la expresión de SUBT en 1,2 veces. No se observaron variaciones significativas en los niveles de expresión de LeuAP ni CND41. En el ensayo de invernáculo, cuatro de las seis proteasas analizadas (SAG12, PAP, SUBT y LeuAP) mostraron una fuerte inducción (3 a 6 veces) en hojas senescentes comparadas con las hojas no senescentes. Por otro lado la expresión de CND41 disminuyó con la senescencia (0,25) mientras que CPMIII no pudo ser detectada en estas muestras. Por último, en las hojas de plantas cultivadas a campo se observó que SAG12, PAP, SUBT, CPMIII y LeuAP se indujeron con el progreso de la senescencia, mientras que la expresión de CND41 se vio reprimida. Estos resultados demuestran que cinco (SAG12, PAP, SUBT, CPMIII y LeuAP) de las seis proteasas en estudio se asocian en forma positiva con el progreso de la senescencia foliar en cebada tanto en plantas jóvenes (senescencia inducida) como adultas (senescencia natural) siendo SUBT (una serín-proteasa) y PAP (una cisteín-proteasa) las enzimas con más altos niveles de expresión. En el caso de CND41 (una proteasa aspártica) nuestros resultados demuestran que esta enzima se asocia en forma negativa con el progreso de la senescencia, siendo su expresión de mayor importancia en tejidos verdes o no senescentes. La relación entre las serín-proteasas tipo subtilisina y la removilización de N ha sido previamente demostrada en plantas de trigo por nuestro grupo de trabajo mientras que la participación de PAP en dicho proceso ha sido recientemente sugerida por otros autores. Esta información junto con los resultados aquí reportados señalan a las proteasas SUBT y PAP como los mejores candidatos para continuar con el estudio de la proteólisis asociada a la senescencia en plantas de cebada.