Analysis and expresión ofthe first protein kinase Ca2+ dependent (OtCDPK1) in the marine unicellular algae Ostreococcus taruri

G.F. CALÓ; H.G. PONTIS; G.L. SALERNO

La Plata

Congreso; IX Congreso de Ficología de Latinoamérica y el Caribe -VII Reunión Iberoamericana de Ficología; 2011

Universidad Nacional de la Plata

La fosforilación de proteínas es un mecanismo ubicuo en la mayoría de los organismos. Las quinasas de proteínas dependientes de calcio (CDPKs), son un grupo de proteínas sensoras de calcio que actúan como mediadoras de señales en plantas y algas verdes. Las CDPKs son proteínas altamente conservadas en estructura y poseen funciones vinculadas con señales que involucran estrés y desarrollo entre otros procesos. Ostreococcus tauri es el eucariota fotosintético más pequeño descripto y pertenece al grupo de las prasinofitas, uno de los grupos más ancestrales dentro del linaje verde. En el presente estudio identificamos en el genoma de O. tauri un ORF que podría codificar una putativa CDPK. La secuencia deducida de la proteína mostró los típicos rasgos estructurales de la familia de las CDPKs y una alta similitud con CDPKs reportadas. Nos propusimos caracterizar funcionalmente este ORF e investigar si en esta prasinofita las CDPKs cumplen un rol similar al de plantas vasculares. La caracterización del ORF se realizó por expresión en un sistema heterólogo y determinación de actividad catalítica y propiedades inmunológicas. La secuencia codificante correspondiente al ORF (1458 pb) fue obtenida a partir RNA total de células de O. tauri al que luego se lo sometió a retrotranscripción generando el cDNA, que fue expresado en E. coli BL21 como proteína de fusión a una cola de 6xHis. La proteína recombinante presente en la fracción soluble mostró el tamaño esperado (aprox. 58 KDa) y actividad de CDPK. Ensayos de inmunodetección utilizando un anticuerpo específico para la extensión de 6xHis confirmó la presencia de la proteína recombinante en el extracto soluble así también como en la fracción parcialmente purificada y anticuerpos contra el dominio regulatorio confirmaron la identidad de la proteína recombinante. Por ensayos de RT-PCR semicuantitativa, se determinaron los niveles de mRNA en células creciendo bajo diferentes condiciones nutricionales (deficiencia y exceso de nitrógeno, luz y oscuridad). Los resultados muestran la primera caracterización de una CDPK de un picoeucariota fotosintético, que podría estar involucrada en la transducción de señales dependientes de Ca2+, tal como tiene lugar en plantas, y sugieren la aparición temprana de estas proteínas en el linaje verde.