Caracterización bioquímica y funcional de las dos putativas glucosiltransferasas de RE de C.elegans

BUZZI, L, PARODI A Y CASTRO O

Mendoza

Workshop; Caenorhabditis elegans: a powerful model for biological research; 2009

Instituto de Histología y embriología- Facultad de Ciencias Médicas Universidad Nacional de Cuyo

Caracterización bioquímica y funcional de las dos ER GT de C.elegans. Buzzi, L; Parodi A y Castro, O. A. Laboratorio de Glicobiología. Fundación Instituto Leloir Av. Patricias Argentinas 435  Buenos Aires. Argentina. (1405). Existen mecanismos destinados a asegurar que las proteínas alcancen una estructura espacial funcional. Una de las estrategias es el agregado de oligosacáridos a los residuos de Asn permitiendo la interacción de los polipéptidos con lectinas-chaperonas residentes en el Retículo endoplasmático (RE), que reconocen específicamente oligosacáridos monoglucosilados. Estos últimos se pueden formar por deglucosilación parcial del oligosacárido transferido a péptidos nacientes o por reglucosilación de los oligosacáridos libres de glucosa. Esta reglucosilación es catalizada por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT) que se comporta como sensor de la conformación de glicoproteínas. En humanos, se identificaron dos genes (HUGT1 y HUGT2) cuyas secuencias presentan una alta homología con las secuencias de los genes que codifican las GTs de diferentes organismos. Sin embargo, solo la proteína codificada por el gen HUGT1 presenta actividad de GT. La proteína codificada por el gen HUGT2 carece de actividad de GT y se desconoce su papel fisiológico. En C. elegans, se han identificado dos genes (F48E3.3 y F26H9.8) que presentan un alto grado de similitud con las GTs de diferentes organismos y un alto grado de identidad entre ellas, en forma análoga a lo que ocurre en humanos. El objetivo de esta tesina es el estudio y la caracterización bioquímica de las proteínas codificadas por los genes F48E3.3 y F26H9.8. Se comprobó que C. elegans posee actividad de GT a) por estudios de glucosilación in vitro mediante los cuales se identificaron oligosacáridos glucosilados sensibles a endoglicosidasa H y b) analizando la capacidad de la enzima para discriminar entre los estados de plegamiento de las proteínas. Se realizaron estudios de silenciamiento génico mediante los cuales se observó que al depletar a los nematodos de las proteínas codificadas por los genes F48E3.3 y F26H9.8 se observa una disminución en la sobrevida, un envejecimiento prematuro y un alto porcentaje de alteraciones morfológicas. Se determinaron también los niveles endógenos de actividad en gusanos sin tratar y sometidos a silenciamiento génico por ARN de interferencia (ARNi) para el gen F26H9.8. Se observó que los niveles de actividad de GT no disminuyeron cuando se depletó a las células de la proteína codificada por dicho gen indicando que al menos una gran parte de la actividad de GT podría provenir de gen F48E3.3. La caracterización de las proteínas codificadas por los genes F48E3.3 y F26H9.8 se inició con la expresión heteróloga de ambos genes en células de levadura que carecen de actividad de GT. El clonado de las mismas se realizó por el método de clonado in vivo en levaduras ya que la expresión de ambas proteínas había resultado tóxica en bacterias. Las proteínas codificadas por los genes F48E3.3 y F26H9.8 se expresaron en niveles comparables a los obtenidos para otras GTs previamente estudiadas y se localizaron en el compartimiento subcelular correcto, RE, sin embargo resultaron inactivas en los ensayos in vitro e in vivo.