MEDICIÓN DE LA PROGRESIÓN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN MEDIANTE ANÁLISIS DE MOLÉCULAS ÚNICAS DE ADN POR MICROSCOPIA CONFOCAL

MANSILLA SF, SORIA S , SPERONI J, GOTTIFREDI V

Mar del Plata, Argentina

Congreso; LIV Reunión de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2009

SAIC

MEDICIÓN DE LA PROGRESIÓN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN MEDIANTE ANÁLISIS DE MOLÉCULAS ÚNICAS DE ADN POR MICROSCOPIA CONFOCAL. S F Mansilla 1 , G Soria 1 , J Speroni 1 , V Gottifredi 1 1Laboratorio de Ciclo Celular y Estabilidad Genómica, Fundacion Instituto Leloir<smansilla@leloir.org.ar> - CAPITAL FEDERAL Resumen : El proceso de replicación debe lidiar con un alto número de lesiones al ADN provocadas por el metabolismo celular o por agentes externos.  Esto ocasionó que el proceso de replicación del ADN evolucione generando mecanismos de regulación de fidelidad de síntesis y de tolerancia al daño. Normalmente las técnicas utilizadas para medir procesos de síntesis involucran la incorporación de nucleótidos radioactivos o de análogos de bases. La restricción de estos métodos es que  solo permiten medir síntesis de ADN a nivel cuantitativo  de manera limitada.  Resulta muy complejo por ejemplo medir variaciones sutiles en la progresión de la horquilla de replicación que involucran síntesis de pocas bases de ADN, como es el caso de procesos acoplados a fase S. Es por esto que recientemente se desarrollaron métodos de análisis de moléculas únicas de ADN que permiten visualizar cambios en la velocidad de avance de la horquilla de replicación. En nuestro laboratorio logramos poner a punto una técnica novedosa conocida como "Fiber Assay". Este ensayo consiste en la incorporación secuencial de dos análogos de bases (Cldu e IdU) que son detectados diferencialmente por anticuerpos específicos. Luego mediante un proceso de extensión se separan moléculas únicas de ADN desplegadas  donde la incorporación de cada análogo se puede "medir" separadamente por microscopia de alta resolución. Estas incorporaciones se realizan en manera sucesiva en procesos de replicación normal o separadas por un evento de daño al ADN (por ej. irradiación UV). De esta manera es posible estimar en manera sensible variaciones en la progresión de la horquilla de replicación no solo en respuesta a un determinado agente genotóxico sino también  en el estudio del efecto de una proteína particular (ej. un inhibidor de activad polimerasa).