Expresión de Proinsulina recombinante en E. coli y su aplicación en un novedoso inmunoensayo basado en citometría de flujo para la detección de autoanticuerpos en Diabetes Mellitus Autoinmune

BOMBICINO, SILVINA S.; FACCINETTI, NATALIA I.; IACONO, RUBEN F.; SABLJIC, ADRIANA V.; MASCI, I.; TRABUCCHI, ALDANA; PASCUAL, L.; MARFÍA, JUAN I.; VALDEZ, SILVINA N.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; 73º Congreso Argentino de Bioquímica. ¿La Bioquímica: expansión sin límites?; 2019

Asociación Bioquímica Argentina

Introducción: Durante el desarrollo de la Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) los primeros anticuerpos que aparecen en circulación son los dirigidos hacia la proinsulina (PAA), por lo que su detección es muy útil para el diagnóstico precoz de la patología. El método radiométrico de referencia para su detección (Ensayo de Unión de Radioligando, RBA) es de alta sensibilidad y especificidad, pero de alto costo, altamente contaminante y requiere centros con la habilitación necesaria. Por ello, es imprescindible el desarrollo de ensayos no radiométricos, aplicables en laboratorios de menor complejidad que faciliten el acceso al diagnóstico a un mayor número de pacientes.Objetivos: El objetivo del trabajo consistió en la expresión de la proinsulina (PI) en E. coli y su aplicación en el desarrollo de un inmunoensayo basado en Citometría de Flujo (CF) para la detección de PAA.Materiales y métodos: La PI humana fue expresada como proteína de fusión con Tiorredoxina (TrxPI) en E. coli. Se purificó de la fracción soluble intracelular por cromatografía de afinidad y se marcó con biotina. Por otro lado, se obtuvo de los cuerpos de inclusión (CI) con 98% de pureza.Se analizaron 36 sueros de individuos controles normales y 24 muestras de pacientes infanto juveniles con DM1, PAA positivos por RBA. Para la CF se empleó un modelo de doble paratope en el cual se incubaron por 4 días, los sueros con 3,6 ng de TrxPI-biotina y 6,6x103 microesferas de 5 µm adsorbidas con TrxPI purificada de los CI. Los inmunocomplejos formados fueron reportados empleando estreptavidina-Ficoeritrina. Se analizó la media geométrica (GeoM) de las señales obtenidas y los resultados se expresaron en Standard Deviation scores (SDs= (GeoMsuero analizado-GeoMmedia controles normales)/Desvío Estándarcontroles normales). Resultados: La mediana de los resultados obtenidos por CF con los controles normales resultó significativamente diferente a la de los pacientes (p=0,0068). Para seleccionar el cut off con la máxima sensibilidad y especificidad, se realizaron curvas trazando dichos parámetros frente a los valores de cut off correspondientes, seleccionándose SDs>3,0 como umbral de positividad. Así, la especificidad del método fue de 86,1% y la sensibilidad del 58,3% ya que, de los 24 sueros de pacientes evaluados, 14 fueron positivos con un rango de señales entre 1,113 y 30,294 SDs y mediana de 3,880. Se analizó el área bajo la curva ROC: 0.7054, indicando que el método presenta una performance aceptable. Conclusiones: Se logró desarrollar un inmunoensayo por CF para la detección de PAA con buena sensibilidad y menor complejidad e impacto ambiental que el RBA. Los resultados factibilizan el desarrollo de inmunoensayos que permitan detectar de forma múltiples marcadores de DM1 en un único acto analítico, empleando microesferas de distinto tamaño o fluorescencia interna adsorbidas con los diferentes autoantígenos, que pueden diferenciarse fácilmente en el citómetro de flujo.