IDEHU   05542
INSTITUTO DE ESTUDIOS DE LA INMUNIDAD HUMORAL PROF. RICARDO A. MARGNI
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Clonado y expresión de la proteína de Trypanosoma cruzi Tc52 y sus dominios en E. coli y células de mamífero.
Autor/es:
MATOS MN; CAZORLA SI; RAMIREZ CV; MALCHIODI EL
Lugar:
Santa Fe, Santa Fe, Argentina.
Reunión:
Congreso; XXIII Reunión Científica Anual. Sociedad Argentina de Protozoología; 2009
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Protozoología
Resumen:
Clonado y expresión de la proteína de Trypanosoma cruzi Tc52 y sus dominios en E. coli y células de mamífero. Matos MN, Cazorla SI, Ramirez CV, Malchiodi EL. Cátedra de Inmunología-IDEHU, CONICET-UBA, Facultad de Farmacia y Bioquímica y Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. La proteína de T. cruzi Tc52 con función glutatión transferasa, posee además propiedades inmunomoduladoras actuando sobre diferentes células del sistema inmune. Tc52 modula la expresión de citoquinas por células dendríticas y macrófagos e inhibe la proliferación de linfocitos T por mitógenos. Por estas características es un interesante candidato para el diseño de vacunas y para el estudio de sus propiedades inmunomoduladoras. Tc52 está constituida por dos dominios, el amino terminal de 26 kDa que es el sitio activo, y el carboxilo terminal de 25 kDa, de función desconocida. El alineamiento de secuencias de bases de ambos dominios reveló que poseen un 26% de identidad y un 28% de similitud. Para disponer de la proteína recombinante clonamos a Tc52 y sus dos dominios en vectores de expresión procariota y eucariota. Se realizaron PCRs utilizando como templado el ADN genómico extraído de epimastigotes de la cepa RA de T. cruzi. Los productos de PCR de 1377, 717 y 708 pb, correspondientes a la proteína completa, dominio N- y C-terminal, respectivamente, fueron digeridos con enzimas de restricción y ligados al plásmido pET23a. Para la clonación en vectores de expresión eucariota, los productos de PCR digeridos con enzimas de restricción, fueron ligados al plásmido pcDNA3.1. Se seleccionaron los clones por su resistencia a ampicilina y se evaluó la presencia de los insertos por digestión enzimática y PCR. Los clones fueron secuenciados obteniéndose mas de 99% de identidad respecto a la secuencia AF117240 (cepa Y de T. cruzi). Las construcciones en pET23a se usaron para transformar células E. coli BL21. Las células fueron crecidas hasta DO600nm = 0.8, induciéndose la expresión con 1 mM  IPTG durante 4 h. Las proteínas fueron purificadas en condiciones desnaturalizantes por cromatografía de afinidad utilizando columnas de Ni-NTA y replegadas posteriormente por diálisis contra PBS. Las proteínas recombinantes fueron reconocidas por Western blot utilizando anticuerpos anti-His. Por inmunización con adyuvante de Freund se obtuvo suero de ratones específicos contra Tc52 y contra cada uno de los dominios. Estas construcciones nos permitirán: 1-evaluar la respuesta inmune obtenida frente a Tc52 y sus dominios; 2- realizar ensayos de inmunoprotección con las proteínas y los ADN correspondientes; 3- analizar la función inmunomoduladora de la Tc52, discriminando la importancia de cada dominio en dicha función; y 4- realizar estudios estructurales.