DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS ANTI-ZNT8 MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO PARA EL APOYO DIAGNÓSTICO EN DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE

FACCINETTI, NATALIA I.; BOMBICINO, SILVINA S.; VALDEZ, SILVINA N.; GUERRA, LUCIANO L.; TRABUCCHI, ALDANA; SABLIJC, ADRIANA V; MARFÍA, JUAN IGNACIO; POSKUS, EDGARDO

Buenos Aires

Congreso; 17 Congreso Internacional de Medicina Interna del Hospital de Clínicas ?José de San Martín?; 2018

Hospital de Clínicas "José de San Martín"

Introducción: La diabetes mellitus (DM) tipo 1 es un trastorno autoinmune que se origina por una pérdida de la tolerancia hacia componentes propios de las células beta pancreáticas productoras de insulina, lo cual lleva a la destrucción de estas células por acción de los linfocitos T citotóxicos. Como consecuencia de ello, se generan autoanticuerpos dirigidos contra diferentes antígenos de las células beta pancreáticas, entre los cuales se encuentran los que presentan especificidad hacia la isoforma 8 del transportador de Zn (ZnT8) específico de célula beta. Su detección, en combinación con los marcadores clásicos de la patología, incrementa la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad en pacientes con DM tipo 1 y en LADA (diabetes autoinmune latente del adulto). El objetivo del trabajo consistió en el desarrollo y optimización de un inmunoensayo para la detección de anticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A) basado en Citometría de Flujo (CF), aplicable al apoyo diagnóstico en DM autoinmune.Materiales y Métodos: Se emplearon 100 sueros de individuos controles normales y 76 muestras de pacientes infanto juveniles con DM tipo 1, de los cuales 69 eran ZnT8A positivos por el método de referencia (Ensayo de Unión de Radioligando -RBA-). Para la CF se empleó un modelo de doble paratope en el cual se incubaron, en primer lugar, los sueros con microesferas de poliestireno de 4 µm adsorbidas con un heterodímero del dominio C terminal de ZnT8 (aa 268-369) formado por dos monómeros que difieren en el aminoácido de la posición 325, teniendo uno Arg y el otro Trp, expresado en E. coli (cepa GI724) como proteína de fusión con Tiorredoxina (TrxZnT8). Luego, se incubó con TrxZnT8 biotinilada y, finalmente, los inmunocomplejos formados fueron reportados empleando estreptavidina conjugada a Ficoeritrina. La detección por CF se realizó a λexcitación= 488 nm. Se analizó la media geométrica (GeoM) de las señales obtenidas y los resultados fueron expresados en Standard Deviation scores (SDs= (GeoMsuero analizado-GeoMmedia controles normales)/Desvío Estándarcontroles normales). Se consideraron positivas las muestras cuando el valor de SDs > 2,5. La significación estadística se evaluó mediante un test no paramétrico: test U de Mann-Whitney para datos no pareados y se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.Resultados: La mediana de los resultados obtenidos con los sueros de individuos controles normales resultó significativamente diferente a la de los sueros de pacientes con DM tipo 1 (p < 0,0001). De los 76 pacientes estudiados, 47 fueron positivos para el protocolo de CF modelo doble paratope, con señales que oscilaron entre 1,37 y 23,79 SDs y mediana de 2,89. Cabe destacar que 5 pacientes negativos por RBA fueron detectados como positivos por CF. Este método mostró una especificidad del 98,0 %, y una sensibilidad de 61,8 %. Asimismo, de los 69 sueros ZnT8A positivos por RBA, 42 resultaron positivos cuando se los evaluó por CF, mientras que 27 fueron negativos, obteniéndose una sensibilidad analítica del 60,9 %.Conclusiones: Se logró desarrollar un inmunoensayo con buena sensibilidad y menor complejidad e impacto ambiental que el método de referencia, para la detección de autoanticuerpos anti-ZnT8 mediante el uso de microesferas con detección fluorescente. Los resultados obtenidos factibilizan el desarrollo de inmunoesayos para la detección simultánea y discriminativa de los principales marcadores de autoinmunidad en DM, empleando microesferas de distinto tamaño o fluorescencia interna adsorbidas con los diferentes autoantígenos, las cuales son fácilmente identificadas en el citómetro de flujo.