“Clonado y expresión de la proteína de Trypanosoma cruzi Tc24 en bacterias y células eucariotas”.

RAMIREZ CV, CAZORLA SI, MATOS MN, MALCHIODI EL

Santa Fé

Congreso; XXIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2009

Tc24 es una proteína ligadora de Ca++, que se asocia a los rafts lipidícos de la membrana flagelar de Trypanosoma cruzi mediante una doble acilación en su extremo N-terminal. Aunque se sabe que funciona como sensor de Ca++ intracelular, se desconoce por qué mecanismos lo hace. Así como también se desconoce cuál es el rol del profundo cambio conformacional que sufre esta proteína cuando se encuentra en presencia de este catión. Por otro parte, se ha determinado que es un antígeno de excreción-secreción con una potente actividad mitogénica. Para producirla en forma recombinante hemos clonamos el gen en un vector de expresión procariota. Para ello, se amplificó la secuencia por PCR a partir de DNA genómico de epimastigotes de la cepa RA, y el fragmento resultante se digirió con enzimas de restricción que direccionaron la ligación en el plásmido pET23a+. Las construcciones resultantes se secuenciaron comprobandose un 99% de identidad con las secuencias previamente reportadas. Con el plásmido resultante se transformaron células competentes E. coli BL21, que se cultivaron en medio LB a 37ºC con agitación hasta un valor de DO600 igual a 0.7. La expresión de la proteína se indujo con el agregado de 1 mM de IPTG durante 4 h. Por Western Blot frente a suero de ratones infectados con T. cruzi y con un anticuerpo monoclonal anti-His se pudo de manifiesto la expresión de la proteína recombinante en forma soluble. La proteína Tc24 fue purificada por cromatografía de afinidad usando resinas Ni-NTA en condiciones nativas con un rendimiento de 7.5 mg/ml. Por inmunización con adyuvante de Freund se obtuvo suero de ratones anti-Tc24. Por otra parte, el gen de Tc24 se ligó al vector pCDNA3.1+ de expresión en células eucariotas. Con esta construcción se transfectaron células COS-7 y se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para evaluar la eficiencia de transfección y la expresión  de la proteína. Por Western blott del sobrenadante de las células tranfectadas se comprobó que la proteína recombinante es secretada al medio de cultivo. De esta manera se obtuvieron las construcciones plasmídicas, que serán utilizadas para evaluar el papel de la Tc24 en la modulación de la respuesta inmune frente a la infección por T. cruzi, y su rol como herramienta en el proceso de infección.