DESARROLLO DE INMUNOENSAYOS EN FASE SÓLIDA CON GAD65 EXPRESADA EN CÉLULAS DE INSECTO PARA APOYO DIAGNÓSTICO DE DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE

FACCINETTI, NATALIA I.; BOMBICINO, SILVINA S.; GUERRA, LUCIANO L.; MIRANDA, MA. VICTORIA; MARFÍA, JUAN IGNACIO; TRABUCCHI, ALDANA; SABLJIC, ADRIANA V; VALDEZ, SILVINA N.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; VII Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2017

Facultad de Ciencias Veterinarias

La Diabetes Mellitus tipo 1A es una enfermedad autoinmune órgano-específica que se caracteriza por la destrucción de las células beta pancreáticas, llevando a la deficiencia de insulina. Luego de la lisis celular debido al ataque de los linfocitos T citotóxicos, se quiebra la tolerancia inmunológica hacia componentes propios de los islotes pancreáticos generándose como consecuencia autoanticuerpos específicos para las células beta pancreáticas y sus productos. Los principales autoanticuerpos (marcadores) generados son: anti-glutamato decarboxilasa (GADA), anti-tirosina fosfatasa IA-2 (IA-2A), anti-insulina/proinsulina (IAA/PAA) y anti-proteína transportadora de zinc (ZnT8A), siendo estos dos últimos específicos de células beta pancreáticas. Estos autoanticuerpos pueden estar presentes varios años antes del debut clínico. Los GADA presentan una alta prevalencia en pacientes con debut reciente de Diabetes Mellitus tipo 1A. El screening de este marcador humoral es importante para la identificación de sujetos diabéticos con componente autoinmune. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar inmunoensayos de fase sólida no radiométricos de bajo costo y elevada sensibilidad para la detección de GADA, empleando etiquetas enzimáticas acopladas a un revelado colorimétrico (ELISA) o luminométrico (Quimioluminiscencia -QL). Para ello, se utilizó como antígeno glutamato decarboxilasa (GAD65) expresada en el sistema eucariota baculovirus-células de insecto. Los inmunoensayos se basaron en la doble interacción de GADA, presente en los sueros de pacientes, tanto con el antígeno inmovilizado a la placa como con el antígeno soluble marcado con biotina. Por ELISA se evaluaron 45 sueros de pacientes diabéticos GADA+, mientras que por QL se evaluaron 43 sueros GADA+. Se procesaron simultáneamente 46 sueros humanos normales para el cálculo del valor de corte. Los resultados se expresaron en score de desvío estándar (sDS). Se comparó la performance del diseño frente al método de referencia (RBA). El diseño de ELISA alcanzó una sensibilidad relativa a la del RBA del 68,9% y una especificidad del 100,00%, con SDs que fueron desde 3,24 a 48,81, y una mediana de 7,45. El QL-ELISA presentó una sensibilidad relativa del 44,2 % y una especificidad del 100,0% con un rango de 3,08 a 29,70 y una mediana de 1,56. En conclusión, con GAD65 recombinante producida en células de insecto fue posible desarrollar inmunoensayos en fase sólida de elevada especificidad y sensibilidad para la detección del marcador GADA. Los resultados obtenidos factibilizan la implementación de dichos inmunoensayos no radiométricos para la prospección del marcador en laboratorios de mediana y baja complejidad.