Sensibilización a la apoptosis intrínseca en células de LLC mediante la combinación de fármacos dirigidos a respuestas de estrés celular

DURÁN T; KORNBLIHTT L; GIL FOLGAR, M; BLANCO G; LOMBARDO T

Congreso; XXIII Congreso Argentino de Hematología, Sociedad Argentina de Hematología; 2017

Antecedentes Eltratamiento para LLC se basa en fármacos que inducen apoptosis intrínseca omitocondrial (agentes alquilantes, análogos de nucleósidos, anticuerposanti-CD20, BH3 miméticos, etc), lo cual supone superar todas las respuestas deestrés (RE) que promueven la supervivencia celular. La falta de respuesta altratamiento podría responder a una mayor influencia de estas RE, como porejemplo la mitofagia, la biogénesis mitocondrial y el sistema ubiquitina-proteasoma.Sin embargo, la creciente adicción de las células de LLC (cLLC) a estas RE,podría volverlas más sensibles a su inhibición farmacológica.Objetivo Se evaluó en un pac.LLC alto riesgo (AR-C) y otro bajo riesgo (BR-A), la potencia citotóxica dedrogas dirigidas a apoptosis mitocondrial (trióxido de arsénico, ATO),inhibición de mitofagia/autofagia (vincristina, VCR), inducción de biogénesismitocondrial (ácido valproico, VPA) e inhibición del proteasoma (MG132), y seanalizó la presencia de estas RE por métodos bioquímicos.Metodología Pac AR-C almomento del estudio: Rai (III, IV) /Binet C con 16 años de evol. Recibióagentes alquilantes en 3 oportunidades, aprox. c/4 años por progresión conadenomegalias y trombocitopenia. Pac BR-A: Rai(0)/Binet A, sin tratamiento ycon enfermedad estable.Las cLLC desangre periférica se separaron por gradiente de ficoll (pac con linfocitosis, >80%cLLC CD23+CD5+CD19+) y se trataron con ATO, VPA, VCR, y MG132 por 72h. Se evaluóla viabilidad por citometría de flujo (CF) con fluoresceína diacetato e iodurode propidio. Se calculó la cc de efecto medio citotóxico (EC50) de los fármacosindividuales y combinados y el índice de combinación (CI) por el método deChou-Talalay (CI <1 =sinergismo, CI=1 aditividad. CI>1 antagonismo). Seutilizó marcación con nonyl-n-acridina, mitotracker red y monodancylcadaverina,seguido de CF y microscopía de fluorescencia.Resultados Las EC50 deATO, VPA, VCR y MG132 en AR-C fueron 3.05 µM, 1.42 mM, 0.62 µM y 0.94 µMrespectivamente, destacándose la alta potencia de VCR. Como referencia, lasEC50 para los mismo fármacos en línea celular de linfoma de Burkitt fueron ATO=10µM,VPA=6.1 mM, VCR > 100 µM y MG132=1µM. En BR-A la VCR tuvo muy baja potenciacitotóxica (EC50= 10.08 µM), mientras que MG132 fue muy potente (EC50=0.64 µM).Esto indica que la mitofagia y la autofagia no tendrían una gran influencia enla supervivencia de cLLC de BR-A. En AR-C, las combinaciones ATO+VPA, ATO+VCR yVPA+VCR fueron sinérgicas (CI = 0.881, 0.773 y 0.603, respectivamente). Estosugiere que la inhibición de la mitofagia y la autofagia pueden ser muycitotóxicos para las cLLC en AR-C. Además, la combinación ATO+VPA+VCR fuesinérgica (CI=0.535), confirmando que VPA+VCR aumenta la potencia citotóxica relativade ATO. MG132 no tuvo ninguna contribución adicional en la combinación ATO+VPA+VCR+MG132(CI=0.6), sugiriendo que el proteasoma tiene poca influencia en la resistenciaa la apoptosis.  La evaluación por CF ymicroscopía de fluorescencia confirmó los efectos de ATO, VPA y VCR sobre lamitofagia, autofagia y la biogénesis mitocondrial definidos por el perfil de respuestaa los fármacos en pac. AR-C (aumento de la masa mitocondrial, colocalización deautofagosomas/mitocondrias y mayor cantidad relativa de autofagosomas con VCR) Conclusiones Las cLLC deAR-C mostraron un perfil de sensibilidad a ATO, VPA, VCR y MG132, en formaindividual y combinada, compatible con la presencia de RE que promueven laresistencia a la apoptosis (mitofagia con biogénesis y recambio mitocondrial).En cambio, las células de BR-A mostraron un perfil de sensibilidad en el que lamitofagia tendría poca influencia en la supervivencia celular. El sistemaubiquitina proteasoma tendría gran influencia en pacientes de bajo riesgo peromenor en los de alto riesgo. Las bajas dosis de VCR y/o inhibidores deproteasoma como Bortezomib, podrían combinarse para aumentar la citotoxicidadde otros fármacos utilizados actualmente en LLC.