IDEHU   05542
INSTITUTO DE ESTUDIOS DE LA INMUNIDAD HUMORAL PROF. RICARDO A. MARGNI
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Baculovirus como vector de expresión de GAD65, un antígeno útil en el desarrollo de inmunoensayos para el diagnóstico de diabetes autoinmune.
Autor/es:
VALDEZ, S.N.; MARFÍA, J. I.; TRABUCCHI, A.; TARGOVNIK, A.; MIRANDA, M. V.; BOMBICINO, S. S.
Reunión:
Congreso; XII Congreso Argentino de Virología.; 2017
Resumen:
Los baculovirus son patógenos de insectos que regulan las poblaciones en la naturaleza. Las propiedades típicas de los baculovirus, como el alto nivel de expresión génica muy tardía, los hacen adecuados como vectores para la expresión de proteínas heterólogas. Por lo tanto, son ampliamente utilizados en combinación con células de insecto o larvas para producir elevados niveles de proteínas recombinantes, brindando las modificaciones postraduccionales que un sistema procariota no es capaz de generar. Como ventaja adicional, los baculovirus infectan únicamente a insectos, siendo una herramienta inocua para el humano. El objetivo del presente trabajo fue la expresión de glutamato decarboxilasa (GAD65), uno de los principales autoantígenos en Diabetes Autoinmune, utilizando el sistema baculovirus-células y larvas de insecto. Se obtuvieron los baculovirus recombinantes (Autographa californica, AcMNPV) mediante cotransfección de células de insecto Sf9 con los plásmidos de transferencia conteniendo el gen de interés y el genoma linealizado de AcMNPV (BaculoGold Bright, Pharmingen). Con una MOI de 0,5 o con 50ul de 107UFP/ml se infectaron células Sf9 y larvas Rachiplusia nu (R.nu) y Spodoptera frugiperda (S.frugiperda), respectivamente y se incubaron a 27°C durante 4 días en oscuridad. GAD65 fue recuperada a partir del pellet celular o del interior de las larvas mediante protocolos de lisis. Luego de la purificación con columna de afinidad, se corroboró su identidad por SDS-PAGE y Western blot (WB). Se realizó la determinación de actividad enzimática midiendo la formación de 14CO2 a partir de L-[U-14C]-ácido glutámico La caracterización inmunoquímica se llevo a cabo mediante radioinmunoanálisis (RIA) utilizando 5 sueros de pacientes diabéticos con anticuerpos anti-GAD65 en presencia de 35S-GAD65 obtenida por transcripción y traducción in vitro empleando un sistema de lisado de reticulocitos de conejo y GAD65 proveniente de Sf9, R.nu y S.frugiperda.Se logró corroborar mediante SDS-PAGE y WB la presencia de una banda de 65 kDa compatible con GAD65. Los niveles de expresión fueron 3,6mg/l de medio de cultivo 95% pura, 1,06mg/g R.nu 95% pura y 5,7mg/g S.frugiperda 97% pura. Dichas proteínas evidenciaron tener actividad enzimática (6,0 Sf9; 1,8 R.nu y 2,1 Spodo UAExmin-1,mg-1). Asimismo, los ensayos inmunoquímicos mostraron que GAD65 de Sf9, R.nu y S.frugiperda inhiben la unión de 35S-GAD65 a los GADA en un 81%, 87% y 80%, respectivamente. En conclusión, se logró expresar eficientemente GAD65 recombinante humana en el sistema baculovirus-células y larvas de insecto. Los resultados obtenidos demuestran que la proteína mantiene la actividad enzimática y es inmunorreactiva frente a sueros de pacientes. En función al rendimiento y pureza obtenidos, se puede concluir que la producción de GAD65 empleando S. frugiperda factibiliza el desarrollo de inmunoensayos para la detección de anticuerpos anti-GAD, útiles en el diagnóstico de diabetes mellitus autoinmune