Expresión de ZnT8 en E. coli y su aplicación en el desarrollo de Inmunoensayos no radiométricos para la detección de autoanticuerpos

FACCINETTI, NATALIA I.; SABLJIC, ADRIANA VICTORIA; ROVITTO, BRUNO D.; POSKUS, EDGARDO; TRABUCCHI, ALDANA; FACCINETTI, NATALIA I.; GUERRA, LUCIANO L.; SABLJIC, ADRIANA VICTORIA; BOMBICINO, SILVINA S.; TRABUCCHI, ALDANA; VALDEZ, SILVINA N.; GUERRA, LUCIANO L.; BOMBICINO, SILVINA S.; VALDEZ, SILVINA N.; ROVITTO, BRUNO D.; POSKUS, EDGARDO

Buenos Aires

Congreso; XX Congreso Argentino de Diabetes; 2016

Sociedad Argentina de Diabetes, SAD

Expresión de ZnT8 en E. coli y su aplicación en el desarrollo de inmunoensayos no radiométricos para la detección de autoanticuerposFaccinetti NI, Guerra LL, Rovitto BD, Sabljic AV, Bombicino SS, Poskus E, Trabucchi A, Valdez SNInstituto de Estudios de la Inmunidad Humoral, Prof. R.A. Margni (IDEHU, CONICET-UBA) y Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA.Introducción: Los autoanticuerpos anti-transportador de Zinc 8 (ZnT8A) son específicos de célula beta y su detección, en combinación con los marcadores clásicos, incrementa la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad en pacientes con DM tipo 1 y en LADA.El objetivo del presente trabajo fue la expresión de ZnT8 recombinante en Escherichia coli y su aplicación en inmunensayos no radiométricos de alta sensibilidad y fácil ejecución para la detección de ZnT8A.Materiales y Métodos: La región C-terminal de ZnT8 fue clonada en el vector pTrxFus. Bacterias E. coli GI724 transformadas con pTrx-ZnT8, se cultivaron a 30oC y se indujeron con Triptófano 3 h a 37oC. La proteína de fusión TrxZnT8 se obtuvo de los cuerpos de inclusión (CI) y se purificó por afinidad, analizándose por SDS-PAGE y Western Blot (WB). Empleando dicha proteína se desarrollaron dos inmunoensayos:1) ELISA PRE-INCUBACIÓN: se incubó TrxZnT8-Biotina con los sueros estudiados, se separaron los inmunocomplejos con Porteína A-Sefarosa y se detectó el antígeno libre por captura en una placa inmovilizada con anticuerpos Anti-Trx.2) CITOMETRÍA DE FLUJO DOBLE PARATOPE: Se utilizaron microesferas de 4 µm inmovilizadas con TrxZnT8 como fase sólida, las cuales fueron incubadas con los sueros bajo estudio. Posteriormente se incubó con TrxZnT8-biotina y avidina?ficoeritrina, como reactivo revelador. Para la optimización de los inmunoensayos se emplearon 20 sueros de pacientes con DM tipo 1 y 22 sueros humanos normales (SHN). Los resultados obtenidos fueron comparados con los del método radiométrico de referencia (RBA).Resultados: El análisis por SDS-PAGE y WB reveló una banda de ~37.5 kDa, compatible con Trx-ZnT8 con un grado de pureza de 90%. Empleando el ELISA DE PRE-INCUBACIÓN se obtuvo una sensibilidad relativa al RBA del 40,0% (DM tipo 1, n=20) y una especificidad del 90,9% (SHN, n=22). Para la CITOMETRÍA DE FLUJO DOBLE PARATOPE los resultados se expresaron en Intensidad de Fluorescencia Media (IFM), arrojando valores de IFMmedia 6,2 y SD 1,3 para los SHN (n=6) mientras que los valores de IFM para los pacientes diabéticos fueron de 20,2, 16,1 y 9,4 (n=3).Conclusiones: Se logró expresar TrxZnT8 recombinante en E. coli correctamente plegada y con alto grado de pureza. Con dicha proteína se desarrollaron dos inmunoensayos; los resultados preliminares de los mismos factibilizan el análisis de un número mayor de muestras para establecer la performance de ambos inmunoensayos para su posterior aplicación.