Expresión de IA-2 recombinante y su aplicación en novedosos inmunoensayos para la detección de autoanticuerpos en Diabetes Mellitus

FACCINETTI, NATALIA I.; GUERRA, LUCIANO L.; TRABUCCHI, ALDANA; ROVITTO, BRUNO D.; IACONO, RUBÉN F.; VALDEZ, SILVINA N.; FACCINETTI, NATALIA I.; SABLJIC, ADRIANA VICTORIA; POSKUS, EDGARDO; TRABUCCHI, ALDANA; VALDEZ, SILVINA N.; SABLJIC, ADRIANA VICTORIA; POSKUS, EDGARDO; GUERRA, LUCIANO L.; ROVITTO, BRUNO D.; IACONO, RUBÉN F.

Buenos Aires

Congreso; XX Congreso Argentino de Diabetes; 2016

Sociedad Argentina de Diabetes, SAD

EXPRESIÓN DE IA-2 RECOMBINANTE Y SU APLICACIÓN EN NOVEDOSOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS EN DIABETES MELLITUSIntroducción. La proteína tirosina fosfatasa 2 asociada a insulinoma (IA-2) es uno de los principales autoantígenos vinculados a Diabetes Mellitus (DM) Autoinmune. Los autoanticuerpos anti-IA-2 (IA-2A) constituyen un marcador del proceso autoinmune que precede a la sintomatología clínica y sirve de apoyo diagnóstico a las formas de DM con componente autoinmune. El objetivo del trabajo fue desarrollar inmunoensayos sensibles no radiométricos con revelado luminométrico y fluorescente para la semi-cuantificación de IA-2A, empleando IA-2 recombinante humana expresada en E. coli. Materiales y métodos. La región intracelular de IA-2 fue expresada como proteína de fusión con Tiorredoxina (TrxIA-2ic) en la cepa GI724. Empleando dicha proteína se desarrollaron dos diseños de inmunoensayos aplicando el modelo de doble paratope con inmovilización de TrxIA-2ic a la fase sólida, incubación con IA-2A y posterior unión con el antígeno biotinilado a través del paratope disponible: 1) ELISA con revelado quimioluminiscente (QL-ELISA), utilizando una placa de poliestireno como fase sólida y avidina-peroxidasa para revelar el inmunocomplejo (IC) y 2) Inmunoensayo basado en el uso de la Citometría de Flujo (FloCMIA, Flow Cytometric Microspheres-based ImmunoAssay), empleando microesferas de 5 µm como fase sólida y avidina-ficoeritrina como revelador del IC. Las muestras de pacientes diabéticos tipo 1 (n=50) fueron analizadas en paralelo por el método de referencia radiométrico (ensayo de unión de radioligando -RBA-) junto a muestras humanas normales. Los resultados se expresaron en Unidades de desvío estándar (SDs). Resultados. El diseño de QL-ELISA alcanzó una sensibilidad relativa a la del RBA del 59,5% y una especificidad del 94,9%, con SDs que van desde -0,71 a 111,20, y una mediana de 3,46. El FloCMIA presentó una sensibilidad relativa del 75,0% y una especificidad del 87,2% con un rango de -1,05-109,70 y una mediana de 7,67. Asimismo, ambos diseños detectaron 5 pacientes positivos que fueron negativos por RBA, reduciendo a 16,0% los pacientes positivos sólo por RBA y a 2% aquellos sin componente autoinmune detectable. Conclusión. Se logró desarrollar métodos de bajo costo, no radiométricos y ambientalmente inocuos para la evaluación de IA-2A, accesibles para muchos laboratorios.