Producción de GAD65 empleando el sistema baculovirus-células de insecto Sf9 y larvas Rachiplusia nu.

BOMBICINO, SILVINA S.; IACONO, RUBÉN F.; TRABUCCHI, ALDANA; SABLIJC, ADRIANA V; VALDEZ, SILVINA N.; ROVITTO, BRUNO D.; MIRANDA, MA. VICTORIA

Buenos Aires

Congreso; XX Congreso Argentino de Diabetes; 2016

Sociedad Argentina de Diabetes

Introducción Los autoanticuerpos anti-glutamato decarboxilasa (GADA) presentan una alta prevalencia en pacientes con debut reciente de Diabetes Mellitus tipo 1. El screening de este marcador humoral es importante para la identificación de sujetos diabéticos con componente autoinmune.El objetivo del presente trabajo fue expresar glutamato decarboxilasa (GAD65) en el sistema eucariota baculovirus-células de insecto y larvas Rachiplusia nu (R.nu) útil en la implementación de ensayos no radiométricos de bajo costo y elevada sensibilidad para la detección de GADA.Materiales y métodos Se confeccionaron los baculovirus recombinantes conteniendo el gen codificante para GAD65 fusionada a His6 como etiqueta de purificación y detección. Las células de insecto Sf9 se infectaron con multiplicidad de infección (MOI) 0,5UFP/¢ y se cosecharon a 4 días post infección. El antígeno recombinante se extrajo de la fracción intracelular soluble y se purificó por cromatografía de iones metálicos inmovilizados utilizando Níquel como ligando. Además, se ensayó la expresión de GAD65 en larvas de insecto R.nu infectadas con 50μl de suspensión viral 107UFP/ml. Luego de 4 días post infección se seleccionaron aquellas larvas que generaron fluorescencia al ser sometidas a luz UV, evidenciando que fueron infectadas. La expresión y purificación se evidenció por SDS-PAGE y Western blot (WB). La inmunorreactividad se evaluó mediante ensayos de desplazamiento del trazador [35S]GAD usando sueros de pacientes diabéticos GADA+.Resultados El análisis por SDS-PAGE y WB tanto de Sf9 como de R.nu reveló una banda de 66kDa compatible con GAD65. Sf9-His6GAD65 fue recuperada de la fracción intracelular de las células y purificada directamente, siendo el rendimiento ̴16μg/x107 células infectadas. Por otro lado, R.nu-His6GAD65 quedó retenida en el interior de la larva, por lo que se están ensayando diversos protocolos de lisis y purificación. El ensayo de inmunorreactividad mostró una inhibición de la unión a [35S]GAD de 44,08% y de 86,64% utilizando Sf9-His6GAD65 o R.nu-His6GAD65, respectivamente.Conclusiones Se logró producir GAD65 recombinante en células de insecto y en larvas. En ambos sistemas la GAD65 mantuvo la integridad inmunoquímica asociada a epitopes conformacionales, evidenciado por el reconocimiento de sueros de pacientes GADA+. Los resultados obtenidos factibilizan la implementación de inmunoensayos no radiométricos para la prospección del marcador GADA.