Sinergismo entre trióxido de arsénico y fármacos dirigidos al recambio mitocondrial (mitofagia, biogénesis) en células de pacientes con LLC

MINISSALE, C; BLANCO, GA; CAVALIERE, V; MAIGUA, G; KORNBLIHTT, L; CABRAL, C

Congreso; 16º Congreso Internacional de Medicina Interna del Hospital de Clínicas; 2016

Introducción La LLC es un linfoma de bajogrado que se caracteriza por una cantidad elevada de linfocitos B maduroscirculantes con una vida anormalmente prolongada. La falta de muerte fisiológicapodría radicar en la disfunción mitocondrial, ya que en ellas se inicia laapoptosis intrínseca. Si bien, la mayoría de los pacientes con LLC tienen unbuen pronóstico, sigue siendo incurable y puede progresar a un linfoma de altogrado con resistencia a medicamentos citotóxicos de primera línea. Se sabe queel trióxido arsénico (ATO) causa daño mitocondrial que conduce a la apoptosis;el ácido valproico (VPA), inhibidor de histona deacetilasa, induce recambiomitocondrial mediante mecanismos moleculares de eliminación (mitofagia) ysíntesis (biogénesis mitocondrial); la vincristina (VCR) bloquea la mitofagiainhibiendo el transporte a través de los microtúbulos; y MG132 es un inhibidordel proteasoma. La mitofagia y la biogénesis mitocondrial son nuevos mecanismosde resistencia identificados en neoplasias agresivas que ocurren en la zonaperinuclear (CPNM). Identificar y revertir esta resistencia es uno de losdesafíos para la combinación de terapias dirigidas. Se la puede estudiaranalizando in vitro la respuesta biológica de las células patológicas de lospacientes cuando se exponen a drogas con potenciales blancos de mecanismosconocidos.                                               Nuestro objetivo es sensibilizar las célulaspatológicas circulantes de pacientes con LLC bajo el efecto citotóxico de lasdrogas mencionada, basándonos en estudios previos realizados con líneascelulares hematológicas.            Materialesy Métodos  Mononucleares de sangre periférica (gradiente de ficol) de 3pacientes femeninas con LLC del servicio de hematología se cultivaron 72hs conATO, MG, VPA (dosis única 3mM) y VCR (dosis única 1 µM) en forma individual ycombinada. La citotoxicidad se evaluó por citometría de flujo luego de teñir conioduro propidio y fluoresceínadiacetato.  Se determinó la dosis con efectocitotóxico 50% (EC50) para c/droga. El efecto de ATO y MG ± VPA y VCR, seevaluó mediante el índice de combinación (IC) con el método de Chou Talalay(IC>1 antagonismo, IC<1 sinergismo, IC=1 aditivo). La mitofagia seanalizó por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia con sondasmono-dancyl-cadaverina (MDC) que marca los autofagosomas, mitotracker red(MTKred) y nonyl-naranja-acridina (NAO) para detectar las mitocondrias. Lacolocalización de mitocondrias y autofagosomas se determinó por microscopía defluorescencia. Resultados El EC50 de ATO y MG disminuyó en formaimportante cuando se  incorporó VPA y VCR(ver tabla):                        sin VPA/VCR         con VPA/VCREC50 ATO (x±SD          4.58 uM ± 0.28    0.49 uM ± 0.14                                                                                   EC50 MG (x±SD)           0.90 uM ± 0.03    0.10 uM ± 0.03                                                                                     El índice de combinación de ATO+MG132 fueantagónica (A) para todos los niveles del efecto citotóxico (0-100%) pero conVPA y VCR, fue sinérgico (S). Como ejemplo, el IC para un efecto EC50 en uno delos pacientes fue: ATO+MG, 1.75 ± 0.13 (A) vs ATO+MG c/VPA y VCR, 0.22 ± 0.06(S). VPA aumentó lamasa mitocondrial y la colocalización mitocondrias/autoagosomas en el  cluster perinuclear mitocondrial (CPNM). Encambio, VCR desorganiza el CPNM ya que las mitocondrias se distribuyenperiféricamente aún en presencia de VPA. Conclusiones ATO y MG 132 fueron antagónicos en los 2 pacientes estudiados perose revirtió a sinergismo con el agregado de bajas dosis de VPA+VCR. VCRincrementó la sensibilidad al ATO±MG132 por bloqueo de la mitofagia ya queaumentó la masa mitocondrial y la colocalización de los autofagosomas. Lascélulas pueden lograr la muerte celular bajo las 4 drogas utilizadas tanto enforma individual como combinadas, atacando diferentes etapas del recambio mitocondrial:bloqueo de la mitofagia (VCR y MG132), biogénesis mitocondrial (VPA) y la inducciónde apoptosis intrínseca x daño mitocondrial (ATO).  Confirmamos otros estudios recientes (algunosclínicos) donde VPA sensibiliza células de LLC a otras drogas que inducenapoptosis intrínseca (por ej fludarabina).