Acción de Enterococcus faecalis CECT7121 sobre células tumorales y su influencia en la respuesta inmune antitumoral

MOLINA MATIAS; CASTRO MARISA; CAVALIERE VICTORIA; AZPIROZ MARIA BELEN; DI SCIULLO P; PAPADEMETRIO DANIELA; ALVAREZ ÈLIDA; MONGINI CLAUDIA; MANGHI MARCELA

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

Simposio; Avances en Inmunología Básica y Aplicada. De la mesada a la clínica; 2008

Las bacterias probióticas, que en su mayoría pertenecen al grupo de las bacterias ácido-lácticas, son conocidas por ejercer efectos benéficos en la salud humana y animal. La ingestión regular de dichos microorganismos contribuye a la homeostasis del sistema inmune alterando el balance microbiano e interactuando con el sistema inmune de mucosas. Por otra parte, según su género y/o especie, los probióticos presentan capacidades inmunomodulatorias específicas, tanto in vitro como in vivo [Vintiñi EO et al, 2000]. Nuestro grupo de trabajo estudia la actividad de Enterococcus faecalis CECT7121 (Ef CECT7121) sobre el sistema inmune empleando diferentes modelos biológicos [Sparo MD et al, 2006; Castro MS et al, 2007; Sparo MD et al, 2008; Castro MS et al, 2008]. Entre los resultados obtenidos se destaca la capacidad in vitro e in vivo de Ef CECT7121 para impedir la progresión del linfoma T murino LBC (modelo tumoral altamente agresivo y pobremente inmunogénico, que ataca al hospedador provocando su muerte en aproximadamente 20 días) [Mongini C et al, 1991; Mongini C et al, 2007]. Mediante estudios in vitro hemos demostrado que el agregado de Ef CECT7121 (5x107 – 5x108 UFC/ml, inactivada por calor) a cultivos de células LBC (5x104 LBC/ml) induce la inhibición en la proliferación de las células tumorales de manera dosis dependiente (p<0,01). Además, se comprobó que el lisado de Ef CECT7121 también inhibe la proliferación de células LBC (p<0,01). Estructuras superficiales de Ef CECT7121 estarían involucradas en este efecto inhibitorio, ya que la pre-incubación de la bacteria con un suero de conejo específico (obtenido en nuestro laboratorio) neutraliza la capacidad inhibitoria sobre las células LBC. Estudios en paralelo muestran que Ef CECT7121 no ejerce un efecto inhibitorio sobre la proliferación de células esplénicas murinas normales. Como continuación de estos estudios, se demostró que el efecto anti-proliferativo de Ef CECT7121 sobre las células LBC se acompaña de la inducción de apoptosis en dichas células (evaluando la morfología celular mediante tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio, y la fragmentación nucleosomal del ADN empleando electroforesis en geles de agarosa). Con la idea de analizar si existe un correlato entre las observaciones hechas in vitro y la acción de Ef CECT7121 in vivo, ratones BALB/c (n=11) tratados intraperitonealmente (ip) con 5x108 UFC/ml de Ef CECT7121 fueron desafiados al día siguiente con células LBC (1x106 LBC/ratón; ip). Al día 26 post-desafío, el 77% de los animales pre-tratados con Ef CECT7121 sobrevivieron, mientras que todos los del grupo control murieron. Los animales sobrevivientes del grupo pre-tratado con Ef CECT7121 fueron re-desafiados el día 27 con células LBC; como control, 4 animales vírgenes fueron agregados al estudio. Al día 52 (25 días después del re-desafío) todos los animales del grupo control murieron mientras que aproximadamente el 89% del grupo en estudio sobrevivió. El estímulo in vitro con células LBC irradiadas sobre células esplénicas de animales pre-tratados con Ef CECT7121 y sobrevivientes al redesafío con las células tumorales permitió poner en evidencia la respuesta inmune de memoria anti-LBC desarrollada en estos animales. Esta proliferación específica fue acompañada por una mayor producción de IFNγ (p<0,05) e IL-12 (p<0,01), con respecto al grupo control. En un acercamiento a modelos tumorales humanos, planteamos el estudio del efecto de Ef CECT7121 sobre la línea celular linfoblastoide humana PL104 (fenotipo CD19+, CD20+, CD22+, CD38+, CD45+, CD79a+, HLA-DR+, cadena lambda, CD71+), la cual fue establecida a partir de la punción de médula ósea de un paciente con leucemia mieloide aguda atípica. Además, analizamos comparativamente los efectos de Ef CECT7121 y drogas antitumorales actualmente en estudio: CAPE (ácido cafeín fenil etil éster; bloqueante de la acción de NF-κB en el núcleo) y MG-132 (bloqueante del proteasoma). Se ensayaron dosis variables del lisado de Ef CECT7121 (1-20 μg de proteína) solas y combinadas con CAPE (12,5 μg/ml) o MG-132 (0,125 μM). Luego de un tratamiento por 48 horas, encontramos que Ef CECT7121 ejerce un efecto inhibitorio dosis dependiente en la proliferación de las células PL104, alcanzando un valor máximo de 80,67±11,02% de inhibición (p<0,001). Sin embargo, el efecto correspondiente al tratamiento combinado de Ef CECT7121 y CAPE (89,7%) es menor que la sumatoria de los efectos individuales de Ef CECT7121 y CAPE (114,4%) (p<0,01). Respecto al tratamiento con MG-132, Ef CECT7121 no modificó el efecto producido sobre PL104. En las condiciones de trabajo empleadas, Ef CECT7121, CAPE y la combinatoria de ambos no indujeron apoptosis de las células PL104 (a 48 horas). Los resultados permiten demostrar que Ef CECT7121 ejerce un efecto directo sobre las células LBC, inhibiendo su proliferación y estimulando su apoptosis. Además, la cepa probiótica en cuestión es capaz de estimular el sistema inmune en ratones BALB/c, favoreciendo la inducción de una respuesta inmune específica que elimina las células tumorales, y generando una respuesta inmune de memoria. En estudios con una línea celular humana (PL104), demostramos que Ef CECT7121 inhibe la proliferación de las células PL104, sin observarse la inducción de apoptosis (a 48 horas de cultivo). Por otra parte, la combinación de Ef CECT7121 y CAPE resulta en un efecto inhibitorio menor a lo esperado según los tratamientos individuales. Este trabajo sienta las bases para la profundización en los estudios de los efectos de Ef CECT7121 sobre diversos modelos tumorales (tanto murinos como humanos), apuntando hacia el desarrollo de nuevas terapéuticas.