Detección y caracterización de autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A) en pacientes argentinos con Diabetes Mellitus Tipo 1

FACCINETTI, N. I.; ROVITTO, B.D.; GUERRA, L. L.; IACONO, R. F.; TRIFONE, L.; POSKUS, E.; TRABUCCHI, A.; VALDEZ, S.N.

Buenos Aires

Congreso; XIX Congreso de la Sociedad Argentina de Endocrinología y Metabolismo; 2015

SAEM

Introducción y objetivosEn el año 2007, fue descripto un nuevo autoantígeno involucrado en Diabetes Mellitus (DM): la isoforma 8 del transportador de Zn (ZnT8). Los autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A) son específicos de célula beta y constituyen un marcador de autoinmunidad adicional a los autoanticuerpos anti-Insulina/Proinsulina (IAA/PAA), anti-Glutamato Decarboxilasa (GADA) y anti-Tirosina Fosfatasa IA-2 (IA-2A). El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los autoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aa 268-369). En esta región existen dos variantes polimórficas en el residuo 325 (Arg/Trp), razón que llevó a algunos autores a analizar la asociación entre la reactividad de los ZnT8A y el polimorfismo SLC30A8. Sin embargo, aún no se encuentra suficientemente definido el papel de este residuo en la inmunorreactividad de este marcador.En este contexto, el objetivo del presente trabajo involucró la detección y caracterización inmunoquímica de los ZnT8A provenientes de pacientes argentinos infanto-juveniles con reciente diagnóstico de DM tipo 1. Para ello se emplearon diferentes variantes antigénicas recombinantes de ZnT8, ya sea con Arg o Trp en la posición 325, o bien construcciones quiméricas que contienen ambos aminoácidos en dicha posición. El objetivo final fue establecer si el residuo 325 del ZnT8 es un determinante clave para definir la inmunorreactividad de los ZnT8A y obtener información acerca del papel de los dímeros en la génesis de estos autoanticuerpos.Materiales y métodosSe evaluaron 100 sueros de pacientes argentinos infanto-juveniles con reciente diagnóstico de DM tipo 1, ingresados en el Servicio de Nutrición del Hospital Nacional de Pediatría Gutiérrez (Buenos Aires, Argentina) desde mayo de 2013 hasta marzo de 2015. Este grupo incluye 49 mujeres y 51 varones, la edad media al diagnóstico fue de 10 ± 4 años y el rango etario de 1 a 17 años. Asimismo se emplearon sueros controles normales obtenidos a partir de individuos sanos (sin historia familiar de DM y libres de enfermedades autoinmunes), utilizados para determinar el cut off en cada uno de los ensayos.La determinación de ZnT8A se realizó mediante la técnica radiométrica de referencia (Ensayo de Unión de Radioligando -RBA-) utilizando distintas variantes antigénicas: ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8-Arg-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325. Las mismas se obtuvieron mediante transcripción y traducción in vitro empleando un sistema de lisado de reticulocitos de conejo en presencia de [35S]metionina (actividad específica 1.175 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA, USA). El RBA consistió en la incubación de alícuotas de 5 µl de sueros humanos durante toda la noche a 4°C con 10.000 cpm del trazador (35S-ZnT8-Trp325, 35S-ZnT8-Arg325, 35S-ZnT8-Trp-Arg325, 35S-ZnT8-Trp-Trp325 o 35S-ZnT8-Arg-Arg325) en un volumen final de 60 µl en buffer RBA (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.15 M, Tween 20 0.15 %, aprotinina 0.1 %, BSA 0.1 %, pH 7.4). Posteriormente, se agregó 50 µl de proteína A-Sepharose 4B FF 50% en buffer RBA y la suspensión se incubó durante 2 hs a temperatura ambiente, con agitación. Las muestras se centrifugaron y los precipitados conteniendo los inmunocomplejos se lavaron con buffer RBA, se resuspendieron en 100 µl de SDS 1% y los sobrenadantes fueron transferidos a viales para ser contados en un contador automático de centelleo líquido. Los resultados se expresaron como porcentajes de unión (B%) con respecto a las cuentas totales agregadas en el ensayo, o como unidades de precisión: SD scores (SDs = (B%suero analizado ? B%media de los controles normales)/Desvío Estándar controles normales)Paralelamente se determinó la presencia de los otros marcadores de autoinmunidad para DM por RBA.Se realizó el análisis estadístico de los resultados empleando el programa de computación Graph Pad Prism, versión 5.03 para Windows.ResultadosSe determinó la prevalencia de ZnT8A, calculada como el porcentaje de pacientes diabéticos detectados como positivos, en forma conjunta con la de los otros marcadores de autoinmunidad. De los 100 pacientes estudiados el 22.0% fue IAA/PAA +, 58.0% GADA +, 53.0% IA-2A+ y 65.0% fue ZnT8A+ para al menos alguna de las variantes antigénicas empleadas. Asimismo se analizó la sensibilidad combinada de los cuatro marcadores (Fig. 1). Es de destacar que 9 pacientes con DM tipo 1 fueron positivos sólo para ZnT8A y que la inclusión de dicho marcador disminuyó el porcentaje de pacientes que dieron negativo para los cuatro autoanticuerpos a sólo un 7%, reduciendo el número de casos de DM tipo 1B o idiopática.De los 65 pacientes ZnT8A+, 8 reconocieron todas las formas recombinantes de ZnT8. La mayoría (56) resultaron positivos para el heterodímero (ZnT8-Arg-Trp325), 25 de los cuales reconocieron además el homodímero ZnT8-Arg-Arg325 y el monómero ZnT8-Arg325. Por otro lado, los niveles de señales obtenidos con el heterodímero fueron significativamente mayores a los niveles alcanzados empleando cualquiera de las otras variantes antigénicas (mediana 17.99 vs. 10.71, 6.32, 5.66 y 4.44 SD score para ZnT8-Arg325, ZnT8-Trp325, ZnT8-Arg-Arg325 y ZnT8-Trp-Trp325, respectivamente; p < 0.05, test t de Mann-Whitney).ConclusionesSe logró abordar la caracterización inmunoquímica de los ZnT8A presentes en pacientes argentinos con DM tipo 1 empleando diferentes variantes antigénicas de ZnT8. Se observó que la incorporación de ZnT8A, en combinación con los marcadores clásicos, incrementa la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad de un 84.0% a un 93.0%, ratificando que ZnT8A constituye un marcador humoral adicional a la tríada ya existente (IAA/PAA, GADA e IA-2A). Además, a diferencia de lo que ocurre con GAD e IA-2, ZnT8 es un antígeno específico de célula beta por lo que la detección de ZnT8A pone en evidencia un daño específico de dichas célulasLa reactividad exclusiva de ZnT8A por las variantes antigénicas que contienen Arginina en el residuo 325 evidenció la existencia de epitopes dependientes del aminoácido presente en esa posición. Además, el empleo de las variantes diméricas puso en evidencia la existencia de epitopes conformacionales discontinuos presentes en dichas construcciones, los cuales fueron reconocidos por los ZnT8A, emulando el posible mecanismo de la respuesta inmune desencadenada in vivo por la estructura cuaternaria de este autoantígeno.La construcción heterodimérica fue la que mostró la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario de ZnT8A, así como la que denotó el más amplio rango dinámico. La inclusión de la determinación de ZnT8A en pacientes con debut dudoso de DM tipo 1 ya que permite disminuir el porcentaje de DM tipo 1B o idiopática. Asimismo, la inclusión de este marcador en individuos de riesgo (familiares en primer grado de pacientes con DM tipo 1) es esencial, en los ensayos terapéuticos (trials) de predicción y prevención de la DM Tipo 1.