Expresión del autoantígeno ZnT8 humano recombinante en Escherichia coli. Caracterización bioquímica e inmunoquímica

ROVITTO, B.D.; FACCINETTI, N. I.; GUERRA, L. L.; TRABUCCHI, A.; POSKUS, E.; IACONO, R. F.; VALDEZ, S.N.

Buenos Aires

Congreso; V Jornadas de Jóvenes Investigadores "Ciencia y Sociedad"; 2015

Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA

El transportador de zinc (ZnT8) ha sido identificado como un autoantígeno vinculado a Diabetes Mellitus (DM). Los autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A) constituyen un marcador del proceso autoinmune que precede a la sintomatología clínica. El objetivo del trabajo fue expresar ZnT8 recombinante apto para la detección de ZnT8A en ensayos inmunoquímicos no radiométricos.La región codificante del C-terminal de ZnT8 fue clonada en el vector de expresión procariota pTrxFus. Bacterias E. coli GI698 se transformaron con el vector pTrx-ZnT8, se cultivaron a 30oC y la expresión de la proteína de fusión con tiorredoxina (Trx) se indujo con Triptofano durante 3 hs a 20oC. La quimera se purificó por cromatografía de afinidad a partir de la fracción intracelular soluble; las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y Western Blot (WB), revelado con un suero policlonal de conejo anti-Trx o anti-ZnT8. La identificación bioquímica de Trx-ZnT8 se realizó por espectrometría de masa (EM) y la capacidad de reconocer ZnT8A en sueros de pacientes se evaluó a través de ensayos de desplazamiento del trazador [35S]-ZnT8 generado en un lisado de reticulocito de conejo.El análisis por SDS-PAGE y WB reveló la presencia de una banda de 36 kDa, compatible con la presencia de Trx-ZnT8. La purificación permitió la obtención de 2 mg Trx-ZnT8/L cultivo con una pureza 90%. El análisis por EM permitió la identificación de la quimera recombinante con un porcentaje de cobertura del 73.61%. El ensayo de desplazamiento del trazador [35S]-ZnT8 mostró la inhibición de la respuesta de un valor medio de 44.8 a uno de 0.78, empleando 30 sueros de pacientes.Se logró expresar y purificar eficientemente ZnT8 como proteína de fusión con Trx en E. coli. Estos resultados avanzados permitirán la implementación de métodos no radiométricos (enzimoinmunoensayos) para la prospección sistemática del marcador ZnT8A en pacientes con DM autoinmune.