Anticuerpos IgG asimétricos bloqueantes inducidos por diferentes inmunoterapia en un modelo murino de alergia

CAROLINA APICELLA, ESTELA REY-ROLDÁN, DIEGO CHIAPPETTA, CLAUDIA MOLINARI, CARLOS BREGNI, JOSE DOKMETJIAN, TERESA GENTILE

Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires.

Simposio; . Simposio “Avances en Inmunología Básica y Aplicada: De la mesada a la Clínica”. Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica.; 2008

Anticuerpos asimétricos bloqueantes inducidos por diferentes inmunoterapias en un modelo murino de alergia.   Carolina Apicella*, Estela Rey-Roldán*, Diego A. Chiappetta**, Claudia Molinari***,Carlos Bregni**, José Dokmetjian*, Teresa Gentile*. *Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral "R.A. Margni" (CONICET-UBA), Facultad de Farmacia y Bioquímica. (FFyB) Universidad de Buenos Aires. (UBA), ** Departamento de Tecnología Farmacéutica. FFyB – UBA, *** Cátedra de Bioestadística. FFyB – UBA   La inmunoterapia específica es hasta el momento el único tratamiento efectivo y potencialmente curativo para los procesos alérgicos mediados por IgE, consiste en la administración repetitiva y gradual del alergeno, generando la reducción de los síntomas provocados por las subsiguientes exposiciones. Ha sido descripto que la inmunoterapia se caracteriza por modular la respuesta Th2, y por la inducción de anticuerpos de isotipo IgG4, que se caracterizan por  bloquear al antígeno antes de que genere la respuesta en las células efectoras (anticuerpos bloqueantes). En modelos murinos el desvío hacia los anticuerpos IgG2a, característicos de una respuesta Th1, es indicador del éxito de la inmunoterapia. Considerando que la naturaleza química  del antígeno es crucial para determinar la respuesta inmune desarrollada, la calidad y cantidad de los anticuerpos y el perfil de citoquinas sintetizadas, se han desarrollados sistemas de liberación controlada del antígeno, utilizando ácido láctico y glicólico para generar polímeros  biocompatibles y biodegradables. Estos sistemas liberan el antígeno en forma controlada mimetizando las inyecciones repetidas de los planes convencionales de vacunación, con la ventaja adicional de que carecen de toxicidad. Diversos trabajos han demostrado que entre el 10-15 % de  los anticuerpos IgG presentes en humanos y en diversas especies son asimétricos y que esta proporción se incrementa cuando los estímulos son repetitivos y el antígeno es particulado. Los anticuerpos IgG asimétricos se caracterizan por presentar en el fragmento Fd de la cadena pesada la presencia de un oligosacárido rico en manosa. Este grupo prostético reduce 100 veces la afinidad de uno de los sitios de unión del anticuerpo por el antígeno. Como consecuencia, estos anticuerpos se comportan como monovalentes y bloqueantes del antígeno, previniendo los mecanismos efectores de la respuesta inmune. Teniendo en cuenta estos antecedentes, investigamos la presencia e importancia de los anticuerpos asimétricos bloqueantes específicos, sintetizados durante el curso de diferentes inmunoterapia. Ratones Balb/c fueron sensibilizados vía  ip con 3 dosis de ovoalbúmina (OVA) adsorbida en Al(OH)3  en los días 0, 14 y 28. En el día 50 se obtuvieron muestras de suero y sometieron a diferentes inmunoterapias: 1) PLGA-OVA (1.34 mg de microesferas  de poly-[D,L-lactic-coglycolic acid]) 50:50, conteniendo 50 mg de Ovoalbúmina en 100 µl solución fisiológica, SF) 1 dosis sc en el día 50. (n=5); 2) OVA soluble  (OVA-sol: 50 mg en 100 ml de SF) 3 dosis sc en los días  50, 57 y 64 (n=5); 3) OVA polimerizada (OVA-pol: 50 mg en 100 ml de SF) 3 dosis sc en los días 50, 57 y 64 (n=5). Como grupos controles se incluyeron ratones sensibilizados y tratados con  PLGA, 1.34 mg de microesferas en SF en el dia 50 (n=3) y ratones tratados con SF en los días 50, 57 y 64. (n=3). Los animales fueron sacrificados en el día 85 y las muestras de suero analizadas para determinar los niveles de anticuerpos específicos: IgG asimétricos (ELISA diferencial), IgG1, IgG2a e IgE (ELISA). También con los sueros obtenidos se realizó  a prueba de anafilaxia cutánea pasiva (PCA), en ratones Balb/c normales. Se extrajeron los bazos y en el cultivo de células esplénicas se determinaron los niveles de IL-10 e INFg (ELISA). Los ratones sensibilizados presentaron altos niveles de IgE especificas (DO  490nm: 0.378 ± 0.02 vs 0.023 ± 0.04 para los no sensibilizados) y una mayor relación IgG1/IgG2a respecto a ratones no sensibilizados (DO 490nm= 1.510 ± 0.04/0.620 ± 0.04). Los sueros de los ratones sensibilizados con OVA (dia 50) presentaron una alta reactividad en la reacción de PCA (+++ > 10 mm y mancha azul intensa). Los grupos de animales tratados con antígeno particulado incrementaron significativamente el nivel de anticuerpos IgG asimétricos (PLGA-OVA, 39,2 ± 0.91%, y OVA-pol, 38,4 ± 1.6% p > 0.01), cuando se compararon con los controles tratados con PLGA (26,0 ± 1,0%) o SF (26,7 ± 1.7%). El tratamiento con OVA soluble no generó incremento en los niveles de anticuerpos IgG asimetricos (29.8 % ± 2.5). El tratamiento con PLGA-OVA disminuyó significativamente los niveles de IgG1 (DO490 nm: 1.118 ±  0.067 vs día 50: 1.506±0.044, p<0.05),e indujo un incremento en los niveles de IgG2a específicos (DO490nm 0.869± 0.043  vs día 50: 0.625±0.039 p< 0.05). Sorprendentemente los niveles de IgG1 y de IgG2a no fueron modificados con el tratamiento con OVA-pol. Mientras que el aumento de los niveles de IgG2a observado luego del tratamiento con OVA-sol, (DO490nm: 0.863± 0.017vs día 50, p<0.05) no fue acompañado por variaciones en el título de anticuerpos específicos de isotipo IgG1. No  se observaron variaciones en los niveles de anticuerpos IgE anti-OVA en los grupos sometidos a inmunoterapia especifica (DO490nm OVA sol: 0.241 ± 0.03; OVA pol: 0.424 ± 0,020; PLGA-OVA: 0.359 ± 0.03; PLGA: 0.274± 0.001; SF 0.292 ± 0.05) en concordancia con los resultados obtenidos con otras inmunoterapias. Un marcado descenso de la reactividad en la prueba de PCA se observó con los sueros de  ratones tratados con PLGA-OVA obtenidos en el día 85 (reactividad + = 3-4 mm y mancha azul débil) cuando se compararon con los sueros de los ratones no desensibilizados (reactividad  +++> 10 mm  y mancha azul intensa). La adsorción a Con A de los sueros del grupo tratado con PLGA-OVA revirtió este resultado (reactividad ++ = 5-10 mm  y mancha azul moderada). Los sueros de los ratones tratados con OVA-sol u  OVA-pol  mostraron moderada reactividad (grado; ++ = 5-10 mm y mancha azul moderada) en la prueba de PCA. Los cultivos de esplenocitos  provenientes de los ratones tratados con PLGA-OVA y OVA sol en presencia  de  OVA  luego de 96 hs de cultivo liberaron mayores niveles de IL-10 (PLGA-OVA: 1039 ± 91.7 pg/ml vs. control PLGA 471 ± 28, pg/ml, p<0.01; OVA-sol 932 ±82,5 pg/mL vs control SF :308 ± 68,66 pg/ml p<0.05 ), e IFNγ (PLGA-OVA: 51,59 ± 17,07 pg/ml vs control PLGA 12,77 ± 1,15 pg/ml p<0.01,  OVA-sol 42,66 ± 3,0 pg/ml  vs control SF 10,41 ± 5,2 pg/ml  p<0,05). Nuestros resultados demuestran por primera vez un incremento en los anticuerpos IgG asimétricos debido a la inmunoterapia especifica empleando un antígeno particulado en un modelo murino de alergia. En el caso de los animales tratados con PLGA-OVA este incremento fue acompañado por una disminución en la capacidad de inducir anafilaxia cutánea pasiva además de desviar la respuesta hacia la síntesis de IgG2a y de INFg característicos de un.perfil Th1. El incremento en los niveles de IL-10 podría estar asociado a la activación de la población de LT reg. Finalmente en este trabajo encontramos que entre las inmunoterapias utilizadas, el uso de PLGA-OVA es la única que induce la síntesis de anticuerpos asimétricos acompañada  por un incremento en la respuesta Th1, objetivo principal de la inmunoterapia desensibilizante. Estos resultados sugerirían que el aumento de anticuerpos IgG asimétricos podría prevenir la unión del alergeno a la IgE específica en mastocitos y basofilos reduciendo las reacciones de anafilaxia mediadas por esta inmoglobulina.