Evaluación de fisión mitocondrial en células de linfoma de Burkitt por citometría de flujo

BLANCO G; LOMBARDO T; ALVAREZ E; KORNBLIHTT L

Congreso; XXII Congreso Argentino de Hematología, Sociedad Argentina de Hematología; 2015

IntroducciónLas mitocondrias forman una red y se fusionan y dividen (fisión) regularmente como parte de la dinámica mitocondrial. La fisión es parte de un sistema de control de calidad que impide volver a fusionarse a las mitocondrias que presentan fallas y bajo potencial de membrana (PMM), siendo eliminadas mediante un proceso de autofagia selectivo llamado mitofagia. Las neoplasias agresivas pueden resistir el tratamiento quimioterápico manteniendo altos niveles de mitofagia. Para cuantificar la fisión mitocondrial se utiliza microscopía y métodos morfométricos, siendo limitados en el número de células que puede analizarse.Objetivo Desarrollamos un método de evaluación de fisión mitocondrial por citometría de flujo y lo validamos utilizando el desacoplante CCCP, el cual es un potente inductor de fisión mitocondrial.Métodos Se trataron células de linfoma de Burkitt (CLB) con dosis crecientes de CCCP (5 µM-50 µM) para inducir el colapso del PMM e incrementar la fisión mitocondrial en forma deliberada. Las CLB se marcaron con la sonda potenciométrica tetra-metil-rodamina-éster (TMRE) 150 nM y con la sonda nonyl-naranja-acridina (NAO) 50nM que se une a la cardiolipina, presente únicamente en mitocondrias. Primero realizamos una adquisición de células enteras, utilizando el FSC en modo lineal como señal ?threshold? en un citómetro Partec PAS III. Luego la muestra de células fue suspendida en 100 µl de buffer salino, sometidos a 10 ciclos de presión por pasaje a través de una aguja G27, para obtener las partículas subcelulares (PSC) y corrida inmediatamente. La adquisición de las PSC se realizó utilizando la señal de la sonda NAO (515nm) como ?threshold?, a fin de analizar sólo mitocondrias. Para confirmar la fisión se observaron muestras marcadas en paralelo por microscopía de fluorescencia.Resultados a) Células enterasLas CLB sin tratar mostraron alta señal de NAO y TMRE y sirvieron de referencia respecto de la masa mitocondrial y PMM basal respectivamente en células enteras. Las dosis crecientes de CCCP (5µM a 50µM) provocaron el colapso del PMM y una leve reducción de la señal de NAO a los 30 min, sin observarse pérdida de viabilidad ni a los 30 min ni aun a 72hs. Por microscopía de fluorescencia se confirmó que CCCP indujo fisión en forma dosis dependiente (5µM-50µM) y se observó además la formación de agregados mitocondriales en la zona perinuclear.b) Partículas subcelulares Los controles basales mostraron señal de NAO y de TMRE indicando que el PMM se conservó durante el proceso de ruptura sin afectar la función mitocondrial. Los eventos detectados correspondieron a mitocondrias de diferentes formas y tamaños (log FSC vs. Log SSC). Una fracción menor correspondió a células sin romper detectada como un cluster separado NAO+TMRE+. Las mitocondrias formaron a un cluster diagonal con intensidades intermedias a bajas de NAO y TMRE. El tratamiento con CCCP indujo una disminución de la señal TMRE en la dosis más bajas (