Expresión de Proinsulina humana recombinante en E. coli para la caracterización y detección de autoanticuerpos específicos en diabetes autoinmune

TRABUCCHI, ALDANA; IACONO, RUBEN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XVI Congreso Argentino de Diabetes.; 2008

Sociedad Argentina de Diabetes

The diabetes-related attitudes of health care professionals and <!-- @page { size: 21cm 29.7cm; margin: 2cm } P { margin-bottom: 0.21cm } --> Expresión de Proinsulina humana recombinante en E. coli para la caracterización y detección de autoanticuerpos específicos en diabetes autoinmune Trabucchi A, Iacono RF, Poskus E, Valdez SN. Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA, e IDEHU, CONICET-UBA. Buenos Aires, Argentina. Durante la historia natural de la diabetes tipo 1 (DM tipo 1), los autoanticuerpos anti-insulina (IAA) son frecuentemente los primeros marcadores prodrómicos detectados en grupos de riesgo infantiles. Sin embargo, no todos estos sujetos desarrollan posteriormente múltiples autoanticuerpos y expresan la DM. En un trabajo reciente se concluyó que la DM tipo 1 estaría asociada con la exposición temprana a proinsulina (PI) en el contexto de HLA DR4, y que los IAA de alta afinidad reactivos contra PI identificarían a aquellos sujetos con el mayor riesgo de desarrollar la enfermedad. Objetivo: Desarrollar un método alternativo, basado en la obtención optimizada del autoantígeno PI, como proteína de fusión en un sistema de expresión procariota, apto para la aplicación en tests inmunoquímicos no radiométricos para la prospección de PAA y para el estudio de afinidades en muestras de pacientes. Métodos: La región codificante para la PI humana fue clonada en el vector de expresión procariota pTrxFus obteniéndose la construccion pTrxFus-PI con el objeto de optimizar la producción de proteína intracelular soluble (quimera Tiorredoxina-Proinsulina, Trx-PI). Las bacterias GI724 y GI698 transformadas con pTrx-PI se cultivaron a 30ºC y la expresión proteica se indujo con Trp a 37ºC o 20ºC, respectivamente. Luego de la inducción, las bacterias se analizaron por SDS-PAGE 12% y Western blotting revelado con un suero policlonal de conejo anti-PI. La proteína quimérica fue purificada por afinidad y se evaluó su inmunorreactividad frente a sueros policlonales comparándola con un estándar de PI. Resultados: El análisis por SDS-PAGE y Western blotting de los lisados totales correspondientes a las cepas GI724 y GI698 revelaron la presencia de una banda de ~ 21 kDa, compatible con la presencia de Trx-PI. Se logró purificar la proteína quimérica con alto rendimiento y grado de pureza. Los ensayos preliminares de desplazamiento de PI estándar y de la proteína quimérica mostraron curvas paralelas de respuestas en función del logaritmo de las dosis. Conclusiones: Se logró clonar y expresar eficientemente la PI como proteína de fusión con Trx en E. coli. Los ensayos de paralelismo demostraron que la Trx-PI presenta un comportamiento inmunoquímico semejante al estándar de PI. Estos resultados permiten la implementación de métodos no radiométricos (ELISA y quimioluminiscencia) de baja complejidad y más económicos que el procedimiento radiométrico habitual, para la prospección sistemática del marcador PAA y para las determinaciones de afinidad en pacientes con DM autoinmune.