Clonación, expresión y purificación del dominio N terminal de la proteína tirosina fosfatasa IA 2.

LAURA N. F. SOSA; MARTIN E. NOGUERA; MARIO R. ERMÁCORA; EDGARDO POSKUS; MARÍA E. PRIMO

La Plata, Buenos Aires

Congreso; XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

IA‑2 se localiza en la membrana de los gránulos de secreción (GS) de células de origen neuroendocrino. Recientemente se ha demostrado que IA‑2 juega un papel importante en la estimulación de la expresión de proteínas de los GS y en la regulación de los procesos de secreción celular. El mecanismo molecular postulado indica que luego de la exocitosis, cuando IA-2 se localiza en la membrana citoplasmática, se produce un corte proteolítico en el dominio intracelular de IA‑2 (IA‑2ic, residuos 601-979) que le permite migrar al núcleo y activar la expresión de genes[1]. Aunque se postula un rol regulatorio del dominio extracelular (IA-2ec, 35‑576) sobre el clivaje de IA-2ic, se desconoce el mecanismo involucrado. IA-2ec incluye un péptido señal (residuos 1‑35), una región rica en cisteínas (motivo C‑6X‑C‑5X‑C‑8X‑C) y cuatro sitios consenso de clivaje para convertasas tipo furinas (R45R46, K132R133, K386K387 y K447K448). Durante la maduración del gránulo, IA-2ec es digerido en el sitio K447k448 dando origen a la proteína madura. Mientras que IA-2ec de la proteína madura (residuos 449-576) presenta similitud con la familia de dominios SEA[2], nada se sabe en cuanto al procesamiento, destino o función del fragmento N-terminal del IA‑2ec (residuos 35‑447). El análisis de la secuencia N‑terminal de IA-2ec predice un único dominio globular (35-114) (http://globplot.embl.de). Esta región incluye el motivo de cisteínas y el único triptofano presente en IA‑2ec, características altamente conservadas en IA‑2 de distintas especies. El objetivo del trabajo fue expresar y purificar el fragmento N-terminal de IA-2ec (IA‑2ec35‑131, residuos 35‑131), el cual podría generarse in vivo por clivaje en el sitio consenso (K132R133). Para ello, se clonó IA‑2ec35‑131 como proteína de fusión con tiorredoxina. Se expresó en E. coli BL21‑CodonPlus(DE3)-RIL, y la fracción soluble (5 %) se purificó por IMAC (pureza >95 %, ~1 mg/ml). En conclusión, se logró obtener IA‑2ec35‑131 soluble, en concentración y pureza adecuadas, para la caracterización biofísica y estructural.