IDEHU   05542
INSTITUTO DE ESTUDIOS DE LA INMUNIDAD HUMORAL PROF. RICARDO A. MARGNI
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Expresión del autoantígeno ZnT8 humano recombinante en Escherichia coli. Caracterización bioquímica e inmunoquímica
Autor/es:
ROVITTO, BRUNO D.; FACCINETTI, NATALIA I.; GUERRA, LUCIANO L.; TRABUCCHI, ALDANA; POSKUS, EDGARDO; IACONO, RUBÉN F.; VALDEZ, SILVINA N.
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Jornada; V Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2015
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA
Resumen:
El transportador
de zinc (ZnT8) ha sido identificado como un autoantígeno vinculado a Diabetes Mellitus (DM). Los autoanticuerpos anti-ZnT8
(ZnT8A) constituyen un marcador
del proceso autoinmune que precede a la sintomatología clínica. El objetivo del
trabajo fue expresar
ZnT8 recombinante apto para la detección de ZnT8A en ensayos inmunoquímicos no radiométricos.
La región codificante del
C-terminal de ZnT8 fue clonada en el vector de expresión procariota pTrxFus. Bacterias
E. coli GI698 se transformaron con el vector pTrx-ZnT8, se cultivaron a
30oC y la expresión de la proteína de fusión con tiorredoxina (Trx) se
indujo con Triptofano durante 3 hs a 20oC. La quimera se purificó por
cromatografía
de afinidad a partir de la fracción intracelular soluble; las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y Western Blot (WB), revelado con un suero
policlonal de conejo anti-Trx o anti-ZnT8. La identificación bioquímica de
Trx-ZnT8 se realizó por espectrometría de masa (EM) y la capacidad de reconocer
ZnT8A en sueros de pacientes se evaluó a través de ensayos de desplazamiento del
trazador
[35S]-ZnT8 generado en un lisado de
reticulocito de conejo.
El
análisis por SDS-PAGE y WB
reveló la presencia de una banda de »36 kDa,
compatible con la presencia de Trx-ZnT8. La purificación permitió la obtención
de »2 mg Trx-ZnT8/L cultivo con una pureza »90%. El análisis por EM permitió la identificación
de la quimera recombinante con un porcentaje de cobertura del 73.61%. El ensayo
de desplazamiento del trazador [35S]-ZnT8
mostró la inhibición de la respuesta de un valor medio de 44.8 a uno de 0.78,
empleando 30 sueros de pacientes.
Se
logró expresar y purificar eficientemente ZnT8 como proteína de fusión con Trx
en E. coli. Estos resultados
avanzados permitirán la implementación de métodos no radiométricos (enzimoinmunoensayos)
para la prospección sistemática del marcador ZnT8A en pacientes con DM
autoinmune.