Expresión de dos autoantígenos de relevancia en Diabetes Autoinmune en el sistema baculovirus-células de insecto

TRABUCCHI, ALDANA; URTASUN NICOLÁS; TARGOVNIK ALEXANDRA; FACCINETTI NATALIA; GUERRA L; IACONO R; E. POSKUS; MIRANDA MV; S. VALDEZ

Mar del Plata

Congreso; XIX Congreso Argentino de Diabetes; 2014

Sociedad Argentina de Diabetes

Introducción. La detección de autoanticuerpos específicos (marcadores humorales) contra proteínas de la célula beta pancreática permite el diagnóstico precoz de las formas autoinmune de diabetes. Dos marcadores humorales de relevancia son los autoanticuerpos anti-glutamato decarboxilasa (GADA) y los autoanticuerpos anti-tirosina fosfatasa IA-2 (IA-2A).El objetivo del presente trabajo fue expresar glutamato decarboxilasa (GAD65) y la fracción intracelular de IA-2 (IA-2ic) en el sistema eucariota baculovirus-células de insecto útiles en la implementación de ensayos no radiométricos de bajo costo y elevada sensibilidad para la detección de GADA e IA-2A. Materiales y Métodos. Se clonaron las secuencias codificantes para GAD65, IA-2ic con el agregado de una etiqueta His6 en vectores de transferencia de baculovirus. Se obtuvieron los baculovirus recombinantes mediante protocolos estándar de cotransfección de células de insecto Sf9. Las proteínas de interés se expresaron en cultivos en suspensión de Sf9 infectadas a diferentes multiplicidades de infección (MOIs) con los baculovirus recombinantes y se evaluó la cinética de expresión en cada caso por SDS-PAGE y Western blot (WB). Los antígenos se purificaron a partir de un lisado total (LT) de células mediante cromatografía de iones metálicos inmovilizados utilizando Niquel como ligando. Por otra parte, se evaluó la inmunorreactividad de ambos autoantígenos mediante ensayos de desplazamiento de los trazadores [35S]GAD y [35S]IA-2 usando sueros de pacientes diabéticos GADA+ o IA-2A+.Resultados. Se alcanzó un título viral del orden de 5x107 y 1x108 UFP/ml para GAD65 e IA-2ic, respectivamente. El análisis por SDS-PAGE y WB reveló una banda de ̴66kDa compatible con GAD65 y una banda de ̴43kDa compatible con IA2ic. La MOI óptima para la expresión de GAD65 fue 0,5 y para IA-2ic fue 1 al 4º día post-infección. Las proteínas se recuperaron de la fracción intracelular y fueron purificadas directamente, siendo el rendimiento ̴0,8 mg/8 x107 células infectadas. El ensayo de inmunorreactividad empleando GAD65 mostró desplazamiento de la unión de [35S]GAD de un 8,00% a 4,27%, y utilizando IA2ic el desplazamiento de la unión de [35S]IA-2 fue de 11,15% a 1,92%.