IDEHU   05542
INSTITUTO DE ESTUDIOS DE LA INMUNIDAD HUMORAL PROF. RICARDO A. MARGNI
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Detección y caracterización de anticuerpos en Diabetes Mellitus Autoinmune empleando variantes antigénicas de ZnT8
Autor/es:
FACCINETTI NI; GUERRA LL; POSKUS E; IACONO RF; FRECHTEL G; TRABUCCHI A; VALDEZ SN
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; XIX Congreso Argentino de Diabetes; 2014
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Diabetes
Resumen:
Si bien, existen variantes polimórficas del autoantígeno ZnT8 en el residuo 325 de la molécula (Arg/Trp), aún no se encuentra definido el papel de este residuo en la inmunorreactividad de los autoanticuerpos (ZnT8A).Objetivos:-Caracterizar a ZnT8A a través del estudio de las especificidades hacia diferentes formas antigénicas recombinantes-Seleccionar la variante antigénica de mayor sensibilidad y especificidad para la detección de ZnT8A-Expresar en E. coli la variante antigénica seleccionada, útil en la implementación de tests no radiométricos para la detección de ZnT8AMateriales y Métodos:La caracterización inmunoquímica de ZnT8A se realizó mediante ensayo de unión de radioligando utilizando los monómeros [35S]-ZnT8-Trp325 y [35S]-ZnT8-Arg325, los homodímeros [35S]-ZnT8-Trp-Trp325 y [35S]-ZnT8-Arg-Arg325 y el heterodímero [35S]-ZnT8-Trp-Arg325. Se emplearon 100 sueros humanos normales, 50 pacientes con DM tipo 1 y 282 pacientes con debut de DM >30 años e IMC<30.Para la expresión en E. coli las bacterias transformadas con el ADNc de ZnT8 (clonado en el vector pTrxFus) se cultivaron a 30°C y se indujeron a distintos tiempos. El análisis de la expresión proteica se realizó por SDS-PAGE y Western blot (WB) y el control inmunoquímico mediante un radioinmunoensayo competitivo.Resultados:El 62.0% de pacientes con DM tipo 1 fueron ZnT8A+ para al menos alguna de las variantes antigénicas empleadas. El heterodímero ZnT8-Trp-Arg325 detectó el mayor porcentaje de pacientes ZnT8A+ (96.8%) y mostró niveles de señales más elevados. El 16.3% de los pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta fueron ZnT8A+. El homodímero ZnT8-Arg-Arg325 fue el de mayor prevalencia en este grupo (50.0%) presentando el heterodímero una prevalencia del 39.1%.La variante seleccionada para la expresión en E. coli fue el heterodímero. El análisis por SDS-PAGE y WB reveló una banda de ~37kDa, compatible con la presencia Trx-ZnT8. La mayor expresión de la proteína se obtuvo a 3 horas post-inducción, con un rendimiento de 2mg Trx-ZnT8/ L de cultivo. Trx-ZnT8 fue inmunorreactiva frente a los sueros ZnT8A+ evaluados.Conclusiones:El heterodímero, fue la variante antigénica que presentó la mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario de ZnT8A en distintos grupos de pacientes. Se logró expresar esta variante antigénica como proteína de fusión con Tiorredoxina en E. coli, la cual demostró inmunorreactividad.Los resultados obtenidos conducen a la implementación de métodos no radiométricos para la prospección sistemática del marcador ZnT8A en DM autoinmune.