Transportador de ZnT8: Expresión recombinante, purificación y caracterización inmunoquímica de un nuevo autoantígeno de la célula beta pancreática.

FACCINETTI, NATALIA I.; GUERRA, LUCIANO L.; TRABUCCHI, ALDANA; IACONO, RUBÉN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

Los Cocos, Córdoba

Congreso; LXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología.; 2013

SAI

Título: TRANSPORTADOR DE ZINC 8: EXPRESIÓN RECOMBINANTE, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN INMUNOQUÍMICA DE UN NUEVO AUTOANTÍGENO DE LA CÉLULA BETA PANCREÁTICA. Autores : NATALIA FACCINETTI ; Luciano Guerra ; Aldana Trabucchi ; Rubén Iacono ; Edgardo Poskus ; Silvina Valdez Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires (UBA) e Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral, Profesor Ricardo A. Margni (IDEHU, CONICET-UBA)Resumen : El transportador de Zn 8 (ZnT8) ha sido descripto como autoantígeno vinculado a Diabetes Mellitus (DM). Aproximadamente el 70% de pacientes con DM tipo 1 presenta autoanticuerpos anti-ZnT8 (ZnT8A), siendo un marcador adicional del proceso autoinmune que precede a la sintomatología clínica.El objetivo del presente trabajo fue expresar ZnT8 recombinante para el desarrollo de tests inmunoquímicos no radiométricos para la detección de ZnT8A. La región codificante C-terminal de ZnT8 fue clonada en el vector de expresión pTrxFus. Bacterias E. coli GI724 transformadas con pTrx-ZnT8, se cultivaron a 30oC y se indujeron con Triptofano. Los lisados totales (LT), la fracción intracelular soluble (FIS) y los cuerpos de inclusión (CI) se analizaron por SDS-PAGE 12% y Western blotting (WB) revelado con un suero de conejo anti-Trx o anti-ZnT8. La quimera fue purificada por afinidad o por intercambio iónico. La capacidad de Trx-ZnT8 para reaccionar con los ZnT8A presentes en sueros de pacientes con DM se evaluó a través de ensayos de desplazamiento de unión de radioligando (RBA), empleando 35S-Met-ZnT8. El análisis por SDS-PAGE y WB de los LT, FIS y CI reveló una banda de ~37.5 kDa, compatible con Trx-ZnT8. La mayor expresión de la proteína recombinante se observó a 1.5 hs post-inducción. Se logró purificar la quimera de la FIS y de los CI replegados in vitro con una pureza >90%. El ensayo de inhibición de RBA empleando Trx-ZnT8 proveniente de la FIS o de los CI mostró desplazamiento de la unión de 35S-Met-ZnT8 de un 10.1% a 1.1% y a 2.8%, respectivamente. Conclusiones: Se logró expresar y purificar eficientemente ZnT8 como proteína de fusión con Trx en E. coli. Los ensayos inmunoquímicos demostraron que Trx-ZnT8 fue capaz de inhibir la unión del trazador 35S-ZnT8 en el RBA. Estos resultados avanzados conducen a la implementación de métodos no radiométricos (ELISA y quimioluminiscencia) para la prospección sistemática del marcador ZnT8A en DM autoinmune.