Expresión de Proinsulina humana recombinante en sistemas procariotas para la caracterización y detección de autoanticuerpos específicos en diabetes autoinmune.

TRABUCCHI, ALDANA; VILLALBA, ANABEL; IACONO, RUBEN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

Mendoza, Argentina.

Congreso; XV Congreso Argentino de Diabetes; 2006

Sociedad Argentina de Diabetes (SAD)

Durante la historia natural de la diabetes tipo 1 (DM tipo 1), los autoanticuerpos anti-insulina (IAA) son frecuentemente los primeros marcadores prodrómicos detectados en grupos de riesgo infantiles. Sin embargo, no todos estos sujetos desarrollan posteriormente múltiples autoanticuerpos y expresan la diabetes. En un trabajo reciente se concluyó que la DM tipo 1 estaría asociada con la exposición temprana a proinsulina (PI) en el contexto de HLA DR4, y que los IAA de alta afinidad reactivos contra PI identificarían a aquellos sujetos con el mayor riesgo de desarrollar la enfermedad. Objetivo: Desarrollar un método alternativo, para la obtención optimizada del autoantígeno PI, apto para la aplicación en tests inmunoquímicos no radiométricos, integrables a la prospección combinada de la tríada de marcadores GADA/IA-2A/PAA (el modelo pan-específico de mayor sensibilidad combinada, menor costo y baja complejidad operativa para el screening rutinario). Métodos: La región codificante para la PI humana fue clonada en los vectores de expresión procariota pET22b y pTrxFus con el objeto de dirigir la proteína al espacio periplásmico, obteniéndose las construcciones pET22b-PI y pTrxFus-PI, respectivamente. Las bacterias BL21 transformadas con pET22b-PI se cultivaron a 37ºC en medio LB y la expresión proteica se indujo con IPTG 1mM a 37ºC. Las bacterias GI724 y GI698 transformadas con pTrx-PI se cultivaron a 30ºC en medio de inducción y la expresión proteica se indujo con Trp 100 ug /ml a 37ºC o 20ºC, respectivamente. Luego de la inducción, las bacterias provenientes de 1 ml de cultivo se analizaron por SDS-PAGE 12% y Western blotting revelado con un suero policlonal de conejo anti-Trx. Además, se evaluó la capacidad de la PI o Trx-PI para reaccionar con los PAA presentes en sueros humanos a través de radio-ensayos de inhibición (RBA) con 1 suero PAA positivo de alto título. Resultados: El análisis por SDS-PAGE de los lisados totales correspondiente a la cepa BL21  reveló una banda de ~ 11 kDa mientras que el análisis por SDS-PAGE y Western blotting de los lisados totales correspondientes a las cepas GI724 y GI698 revelaron la presencia de una banda de ~ 21 kDa, compatible con la presencia de PI y Trx-PI, respectivamente. Los ensayos preliminares de desplazamiento del trazador 35S-PI en RBA mostraron una respuesta discreta, probablemente debido a la parcial degradación de la PI en el periplasma para la cepa BL21 y al probable ocultamiento de epitopes de la PI por la porción Trx en el modelo de la proteína quimérica. Conclusiones: Se logró clonar y expresar eficientemente la PI en dos sistemas procariotas diferentes. Estos resultados avanzados conducen a la implementación de métodos no radiométricos (ELISA) para la prospección sistemática del marcador PAA en pacientes con DM autoinmune.