DETECCION Y CARACTERIZACION INMUNOQUIMICA DE AUTOANTICUERPOS ANTI- GLUTAMATO DECARBOXILASA EN PACIENTES CON DIABETES MELLITUS AUTOINMUNE.

VILLALBA A, VALDEZ S, TRABUCCHI A, PRIETO M, KROCHIK A, MAZZA C, POSKUS E, IACONO R.

Mendoza

Congreso; XV Congreso Argentino de Diabetes; 2006

Sociedad Argentina de Diabetes (SAD)

La Diabetes Mellitus (DM) tipo 1 y otras formas de DM asociadas a autoinmunidad son detectables precozmente a través de la determinación de autoanticuerpos (marcadores). El marcador más útil es el autoanticuerpo anti-glutamato decarboxilasa (GADA). Nuestro laboratorio ha desarrollado una línea celular CHO-K1 transfectada (GCHO) que expresa en forma estable GAD65 recombinante humana. Objetivos: Detectar y caracterizar los GADA en sueros de pacientes con DM autoinmune utilizando la GAD65 expresada en el contexto eucariota de la línea celular GCHO. Comparar los resultados obtenidos con los del método de referencia para la detección de GADA, ensayo de unión de radioligando (RBA). Métodos: 1) Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), Microscopía Confocal y cuantificación densitométrica de las áreas celulares inmunorreactivas; 2) RBA utilizando el trazador recombinante [35S]‑GAD65 expresado en reticulocitos de conejo.3) Immunogold y Microscopía Electrónica (ME); 4) Marcación metabólica de las células GCHO, inmunoprecipitación y fluorografía. Se procesaron simultáneamente por IFI y RBA 72 sueros de pacientes diabéticos pediátricos tipo 1 debutantes, 14 sueros de pacientes adultos con DM autoinmune y 36 sueros humanos normales (SHN). Los resultados se expresaron en unidades de precisión (Unidades de desvío estándar-SDS). Resultados: De los 36 SHN sólo 1 resultó positivo por IFI (cut-off: densidad media+2 DE). De los 86 sueros de pacientes estudiados, 27 fueron negativos por IFI y por RBA, 23 fueron positivos por RBA y negativos por IFI, 18 fueron positivos por ambos métodos y 18 resultaron positivos por  IFI y negativos por RBA. Por immunogold/ME se identificó la localización subcelular de la GAD. Conclusiones: El gen codificante para la GAD65 expresado en un contexto celular eucariota intacto permitió la síntesis de una forma de GAD65 que es reconocida por los GADA de los pacientes estudiados. La línea celular GCHO, que expresa GAD65 en forma estable, es una nueva herramienta para el estudio de la inmunoreactividad de los GADA de pacientes diabéticos frente a la GAD expresada en un entorno celular similar al de la célula beta pancreática, a diferencia del RBA donde el antígeno se halla en solución diluída. El ensayo de IFI, seguido del análisis digital de las señales para la detección de GADA, alcanzó una especificidad del 97% y permitió detectar la presencia del marcador en sueros de pacientes con DM autoinmune que resultaron negativos por RBA. La marcación metabólica de GAD65 en el contexto celular intacto y posterior inmunoprecipitación con sueros de pacientes permitió confirmar la presencia del marcador en pacientes GADA negativos por el método de referencia (21% del total).