Clonado, expresión y caracterización inmunológica inicial de la Prolil oligopeptidasa de 80 kDa de Trypanosoma cruzi (Tc80).

BIVONA, AUGUSTO; SANCHEZ ALBERTI, ANDRÉS; MATOS, MARINA NADIA; CAZORLA, SILVIA INÉS; MALCHIODI, EMILIO LUIS

Mar del Plata

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología y de la Sociedad de Investigación Clínica; 2012

Sociedad Argentina de Inmunología y Sociedad de Investigación Clínica

Tc80 es una proteína de secreción de T. cruzi expresada principalmente en los estadios de amastigote y tripomastigote. Es una serin proteasa con actividad de prolil oligopeptidasa que degrada componentes de la matriz extracelular como fibronectina, colágeno tipo I y IV, por lo que estaría implicada en la invasión tisular del parásito. Por ello nos propusimos clonar Tc80, expresarla y caracterizarla inmunológicamente para evaluar su utilización en vacunas profilácticas y/o terapéuticas contra T. cruzi. Amplificamos la secuencia codificante por PCR a partir del ADN genómico de epimastigotes de T. cruzi, cepa RA. El amplicón de 2152 pb fue digerido con enzimas de restricción para su ligación al plásmido pET23a+. El inserto obtenido mostró más de un 99% de identidad con la secuencia esperada (GenBank: AF452421.1). Se expresó Tc80 en forma soluble en células BL21 y se purificó por IMAC con Ni-NTA agarosa. El correcto plegamiento de Tc80 se demostró al observar actividad catalítica frente al sustrato específico Z-Gly-Pro-AMC. Por inmunización con Tc80 se obtuvieron sueros de ratones anti-Tc80 que mostraron por inmunofluorescencia reconocer epis y tripomastigotes de T. cruzi. La incubación previa de tripomastigotes transgénicos Tul-beta gal con estos Ac disminuyó su invasión a células Vero. Observamos además, que macrófagos J774 cultivados en presencia de Tc80 presentaban niveles elevados de NO comparados con los controles tratados con PBS (23.1±4.3 µM y 1.0±0.9 µM respectivamente). Por último, inmunizamos ratones C3H los días 0 y 15, con Tc80 y ODN-CpG por vía subcutánea (Sc) o intramuscular (Im). Observamos un elevado título de Ac anti-TC80: Sc (4300), Im (3300), respecto al control inmunizado con PBS (18). Ambos grupos inmunizados presentaron respuestas de DTH en la almohadilla plantar que fueron significativas respecto al control. Actualmente se están realizando los desafíos parasitarios para analizar su capacidad inmunoprotectiva.