Obtención optimizada de cadenas a y b de insulina humana: reactivos escenciales para abordar la caracterización de autoanticuerpos en Diabetes Mellitus Autoinmune

GUERRA, LUCIANO L.; IACONO, RUBÉN F.; TRABUCCHI, ALDANA; FACCINETTI, NATALIA I.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

Buenos Aires

Jornada; • Jornadas Con Ciencia 2011; 2011

Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA

Una etapa inicial en el desarrollo experimental es, frecuentemente, la obtención de un reactivo central para abordar el estudio básico o aplicado en algún campo del conocimiento. Esta primera etapa usualmente coincide con el inicio de una tesis doctoral, por lo que para su resolución será necesario aplicar conceptos y competencias de reciente adquisición en la carrera de grado. El presente trabajo es un reflejo de dicho proceso, presentando la optimización de una metodología que permitió obtener las cadenas A y B de la Insulina humana recombinante. Éstas constituyen antígenos clave para la futura caracterización inmunoquímica de los Autoanticuerpos anti Insulina/Proinsulina detectados en pacientes con Diabetes Mellitus Autoinmune, utilizados en la clínica como apoyo diagnóstico. Metodología: La Insulina humana recombinante se redujo con DitioTreitol (DTT) y los grupos sulfhidrilos libres se bloquearon con Iodoacetamida. La purificación de las cadenas A y B se realizó por HPLC- Fase Reversa (FR-HPLC), empleando una columna C18, eluyendo en gradiente de NH4HCO3 25 mM (buffer A) y NH4HCO3 35 mM/65 % Acetonitrilo (buffer B). La detección de los eluatos se realizó a 215 nm. El peso molecular (PM) de los polipéptidos se determinó por cromatografía de exclusión molecular (CEM,) empleando una columna Superose 12, y Espectrometría de Masa (EM). La detección en la CEM se realizó a 215 nm. Los picos eluídos fueron colectados, y la concentración de proteínas totales se determinó por el método de Biuret-Ácido Bicinconínico. Para la construcción de una Curva de Calibración se inyectaron estándares globulares de PM. El estudio por EM se realizó empleando un equipo MALDI-TOF-TOF (método de ionización: desorción/ionización Láser asistida por Matriz, Analizador de iones: tiempo de vuelo), diluyendo la muestra en ácido sinapínico. Los PMpromedio teóricos para las cadenas A y B carbamidometiladas se calcularon con el predictor MS-Product. La caracterización inmunoquímica de las cadenas A y B se realizó empleando un ELISA de Pre-incubación. Este ensayo consistió en la incubación durante 1 h a 37 °C de diluciones de los polipéptidos con un Anticuerpo (Ac) monoclonal HB 125, específico para los residuos 8-10 de la cadena A de la Insulina humana. Luego, 50 µL de los preincubados se evaluaron en una placa de 96 pocillos sensibilizada con Insulina estándar para detectar Ac libre (evidenciado empleando un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa y revelado agregando el cromógeno TMB). La lectura se realizó a una D.O.450 nm. Resultados: En la figura 1 se muestra el perfil cromatográfico correspondiente a la separación y purificación por FR-HPLC de las cadenas A y B carbamidometiladas (Pico 1 y Pico 2). Ambos picos fueron colectados, y sometidos a CEM para caracterizar sus PM (figura 2). El pico 1 presentó un PM de 5203 Da, y el 2 de 2101 Da. El análisis por EM permitió identificar al Pico 1 como cadena A (PMteórico: 2611,282 Da; PMexperimental: 2611,215 Da) y al Pico 2 como cadena B de la insulina (PMteórico: 3543,762 Da; PMexperimental: 3543,392 Da). En la Figura 3 se muestran los resultados de los estudios de inmunorreactividad obtenidos por el ELISA de Preincubación, donde se verificó que los polipéptidos no disminuyeron la señal por unión del Ac libre a la placa. Discusión: La reducción y carbamidometilación resultó en la descomposición del pico de Insulina en las cadenas A y B, unidas por puentes disulfuro intercatenarios en la molécula intacta. La determinación del PM y la identificación de los polipéptidos (correspondencia entre los PM teóricos y experimentales), se lograron con EM, mientras que el sistema disponible CEM no mostró resultados concordantes. Esto pudo deberse a fenómenos de agregación en las condiciones cromatográficas empleadas, o a errores inherentes al método ya que las proteínas empleadas como estándares de PM tienen estructura globular mientras que las cadenas A y B no necesariamente la presentan. Sin embargo, la CEM permitió el cambio del buffer proveniente de la FR-HPLC (Carbonato de amonio) por PBS, óptimo para los ensayos de ELISA. Los estudios inmunoquímicos evidenciaron ausencia de inmunorreactividad de la cadena A carbamidometilada frente a un anticuerpo monoclonal específico para los residuos A8-A10 de la insulina. Esto indica una pérdida en la conformación de este epitope respecto de la molécula intacta. Sin embargo este resultado no invalida el uso del reactivo en el estudio de epitopes (continuos o discontinuos) involucrados en la inmunorreactividad de otros anticuerpos. Para una caracterización más completa deberán realizarse ensayos empleando otros anticuerpos, monoclonales y sueros policlonales, anti-insulina. En conclusión, la metodología presentada permitió obtener las cadenas A y B de la Insulina humana recombinante, las cuales fueron identificadas por su PM y caracterizadas inmunoquímicamente frente a un Ac monoclonal. Es así que podrán ser empleadas tanto en el desarrollo de inmunoensayos con distintos fundamentos (ELISA, RIA, Citometría de flujo, etc), como en la producción de Ac monoclonales y planes de inmunización de conejos para la obtención de sueros policlonales específicos.