Expresión de proinsulina humana recombinante y su apliccaión en tecnología de resonancia plasmática de superficie para la caracterización de los autoanticuerpos específicos en Diabetes Mellitus

TRABUCCHI, ALDANA; GUERRA, LUCIANO L.; FACCINETTI, NATALIA I.; IACONO, RUBÉN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

San Miguel de Tucumán

Congreso; LIX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2011

Sociedad Argentina de Inmunología

Expresión de proinsulina humana recombinante y su aplicación en tecnología de resonancia plasmática de superficie para la caracterización de autoanticuerpos en Diabetes Mellitus.  Trabucchi, Aldana; Iacono, Rubén F.; Guerra, Luciano L.; Faccinetti, Natalia I.; Poskus, Edgardo; Valdez,Silvina N.  Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral, Prof Ricardo A. Margni (IDEHU) CONICET-UBA Buenos Aires, Argentina   Con el fin de determinar los parámetros de interacción primaria (afinidad Ka y concentración q) de los anticuerpos anti-proinsulina (PAA) en pacientes con Diabetes Mellitus (DM) autoinmune mediante tecnología de Resonancia Plasmática de Superficie (SPR), se expresó proinsulina humana recombinante como proteína de fusión a tiorredoxina (TrxPI) en E. coli. Para evaluar su correcto plegamiento, se realizaron estudios de control de calidad bioquímicos mediante espectrometría de masa obteniéndose un pico mayoritario de PM 22173.5 Da compatible con el PM teórico calculado (22174.17 Da) indicando que se encuentra perfectamente plegada con los puentes S-S formados. Posteriormente se realizó digestión con enzima V8 y mapeo peptídico en comparación a un estándar de proinsulina (PI), los péptidos producto de la digestión que incluirían los puentes disulfuro fueron evaluados mediante MALDI-TOF resultando en lo esperado para un péptido: masa teórica 1378 Da, masa medida 1377 Da. La otra fracción está siendo estudiada. Paralelamente, se realizaron estudios de inmunorreactividad sobre TrxPI para evaluar su empleo en ensayos de SPR. Se implementaron técnicas de radioinmunoanálisis, comparando el comportamiento de TrxPI con PI, frente a un suero policlonal de conejo anti-PI (HPI) y a sueros de pacientes PAA+. Las curvas dosis-respuesta con PI y TrxPI mostraron ser sigmoidales paralelas y superpuestas frente a HPI, o con una diferencia de varianzas no significativas (p<0.05) frente a sueros PAA+. Esto demuestra que TrxPI presenta un comportamiento inmunoquímico prácticamente indistinguible del estándar. Se realizó también un ensayo de inhibición de unión de radioligando empleando 30 sueros de pacientes diabéticos PAA+, e incubando con una dosis micromolar de TrxPI evidenciándose una inhibición prácticamente completa de las señales en la mayoría de los sueros PAA+, demostrándose que TrxPI es reconocida específicamente por los PAA de los sueros de pacientes. Como evaluación adicional del correcto plegamiento de TrxPI, la interacción específica antígeno-anticuerpo fue analizada mediante SPR. TrxPI y PI fueron inmovilizados alternativamente en celdas del chip sensor. Se calcularon las constantes cinéticas de equilibrio (Ka) frente a sueros PAA+. Los valores obtenidos no mostraron diferencia significativa entre TrxPI y PI (1,2 ± 1,6 x 108M-1 vs 1,1 ± 2,2 x 108M-1, respectivamente; p<0,05). Todos estos resultados utilizando sueros de pacientes que reconocen epitopes conformacionales de PI humana demuestran que TrxPI expresada en nuestro laboratorio se generó en su correcta conformación nativa y es factible su implementación en ensayos de SPR.