Expresión de proinsulina humana recombinante y su aplicación en tecnología de resonancia plasmática de superficie para la caracterización de autoanticuerpos en Diabetes Mellitus

TRABUCCHI, ALDANA; GUERRA, LUCIANO L.; FACCINETTI, NATALIA I.; IACONO, RUBÉN F.; POSKUS, EDGARDO; VALDEZ, SILVINA N.

San Miguel de Tucumán, Tucumán

Congreso; LIX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2011

Sociedad Argentina de Inmunología

La Diabetes Mellitus (DM) tipo 1 se asocia a la exposición temprana a proinsulina (PI) en el contexto de HLADR4 y los autoanticuerpos anti-Insulina de alta afinidad reactivos contra PI (PAA) identificarían a los sujetos con mayor riesgo de desarrollar la enfermedad. El objetivo del trabajo fue expresar PI humana recombinante en E.coli como proteína de fusión con tiorredoxina (TrxPI) e implementar la tecnología de Resonancia Plasmática de Superficie (SPR) con el fin de determinar concentración (q) y afinidad (Ka) de PAA en pacientes con DM tipo 1 y en adultos con DM autoinmune. TrxPI fue recuperada de los cuerpos de inclusión y su peso molecular confirmado por MALDI-TOF (22173,5 Da). El comportamiento inmunoquímico de TrxPI fue evaluado por radioinmunoanálisis con sueros anti-PI comparando curvas dosis-respuesta con TrxPI y PI estándar como desplazantes. La superposición de las curvas indicó un comportamiento inmunoquímico idéntico de TrxPI y PI. Además, en un ensayo de inhibición de unión de 35S-PI empleando una dosis micromolar de TrxPI, frente a 30 sueros de pacientes PAA+ se evidenció la inhibición completa de las señales, demostrando que TrxPI es reconocida por los PAA. Para los ensayos de SPR TrxPI fue inmovilizada en una celda del chip sensor. Se calcularon q y Ka de PAA de pacientes diabéticos infanto-juveniles y pacientes con diagnóstico en edad adulta. Los valores obtenidos mostraron diferencia significativa entre ambos grupos (Ka 12,4±16,2x107M-1 vs 2,7±2,3x107M-1, y q 85,5±52,8x10-9M vs 160,7±92,3x10-9M, respectivamente; p<0.05). Los resultados obtenidos utilizando sueros de pacientes que reconocen epitopes conformacionales de PI demuestran que TrxPI se generó en su correcta conformación. La aplicación SPR con TrxPI para la caracterización de PAA reveló valores más bajos de Ka y más altos de q en adultos respecto de la población infanto-juvenil. Esto sugiere una vía etiopatogénica distinta asociada a la progresión lenta en diabetes autoinmune del adulto.