Producción de una molécula quimérica ZnT8/GAD en el sistema Baculovirus-larvas de insecto y su aplicación en el diagnóstico y prevención de la Diabetes Mellitus Autoinmune.

TRABUCCHI, A; MIRANDA, MV; SABLJIC, AV; VALDEZ, SN; BOMBICINO, SS; POSKUS, E; IACONO, RF; MARFÍA, JI

Rosario, Santa Fe

Congreso; XXIII Congreso Argentino de Diabetes; 2022

SAD

Introducción. La evidencia de la autoinmunidad subyacente en DM1 es la aparición de autoanticuerpos, entre ellos autoanticuerpos anti-glutamato decarboxilasa (GADA) y anti ZnT8 (ZnT8A) que presentan una alta prevalencia, individual y combinada, en pacientes debutantes. El screening de estos dos marcadores humorales podría ser una alternativa apropiada para la identificación de sujetos diabéticos con componente autoinmune. El diagnóstico preciso de las diferentes formas de DM autoinmune garantiza el inicio de un tratamiento precoz y adecuado, disminuyendo las complicaciones crónicas de la enfermedad.Objetivos. Expresar una molécula quimérica ZnT8/GAD en el sistema baculovirus-células/larvas de insecto, que combine las regiones inmunodominantes de los autoantígenos en una nueva molécula. Dicha proteína recombinante será utilizada para el desarrollo e implementación de inmunoensayos no radiométricos que permitan la detección combinada de ambos marcadores. Materiales y Métodos. Se generó un baculovirus recombinante conteniendo el gen codificante para la molécula quimérica ZnT8/GAD fusionada a His6 como etiqueta de purificación y detección mediante el sistema de expresión Bac-to-Bac™. Las células de insecto Sf9 se infectaron con multiplicidad de infección (MOI) 1UFP/¢ y se cosecharon a 5 días post infección. La quimera recombinante se extrajo de la fracción intracelular soluble y se purificó por cromatografía de iones metálicos inmovilizados utilizando Níquel como ligando. Asimismo, se evalúo el sobrenadante de cultivo. Además, se ensayó la expresión de ZnT8/GAD en larvas de insecto S.frugiperda y R.nu infectadas con 50μl de suspensión viral 107UFP/ml. Luego de 5 días post infección se seleccionaron aquellas larvas que generaron fluorescencia al ser sometidas a luz UV, evidenciando que fueron infectadas. La expresión y purificación se evidenció por SDS-PAGE y Western blot (WB). La inmunorreactividad se evaluó mediante inmunoensayo revelado con anticuerpos específicos para GAD y ZnT8. Contando con dicha quimera se encaró el desarrollo de inmunoensayos en fase sólida para la detección de autoanticuerpos en muestras séricas.Resultados. El análisis por SDS-PAGE y WB tanto de Sf9 como de las larvas reveló una banda de ̴80 kDa compatible con ZnT8/GAD. Sf9-His6ZnT8/GAD fue recuperada y purificada tanto de la de la fracción intracelular de las células como del sobrenadante de cultivo con un rendimiento de alrededor de 30 mg/L de cultivo. Asimismo, ha sido posible recuperarla a partir del pellet de larvas infectadas (2,2 mg/g larva). Ensayos preliminares en la detección de anticuerpos específicos demostraron que la molécula quimérica ZnT8/GAD proveniente tanto de células como de larvas de insecto es inmunorreactiva, permitiendo la diferenciación de pacientes diabéticos GADA+ y/o ZnT8A+ de la población normal.Conclusiones. Se logró producir ZnT8/GAD recombinante en células y en larvas de insecto. En ambos sistemas la molécula mantuvo la inmunorreactividad evidenciada por el reconocimiento de anticuerpos anti-ZnT8 y anti-GAD. Los resultados obtenidos factibilizan la implementación de inmunoensayos no radiométricos para la prospección de los marcadores ZnT8A y GADA, así como su utilización en ensayos preliminares de inducción de tolerancia en modelos animales.