Liposomas híbridos: una nanoalternativa contra la resistencia de las bacterias

DESIMONE , MARTIN; MUNICOY , SOFIA; ANTEZANA, PABLO E.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXXII CONGRESO ARGENTINO DE QUÍMICA; 2019

AQA

En la actualidad, el aumento de las bacterias resistentes a los diferentes antibióticos tradicionales es una preocupación de la salud a nivel mundial. En este contexto, los Péptidos Antimicrobianos (AMPs) se convierten en una alternativa interesante frente a este problema (1). La gran mayoría de los AMPs interaccionan electrostáticamente con los fosfolípidos de la membrana de la célula microbiana lo que provoca la perturbación de la misma y finalmente la muerte celular. Por esta razón, la probabilidad de que las bacterias generen resistencia ante este mecanismo de acción es menor (2). Sin embargo, el uso de los AMPs como fármacos presenta numerosos desafíos e impedimentos, entre ellos, la baja solubilidad, la pérdida de su estructura terciaria y la baja biodisponibilidad (3, 4). Entre los AMPs más conocidos se encuentra la gramicidina (GRA) constituida por dos pentapéptidos unidos entre sí que forman un anillo (cyclo(-Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro-)2). La gramicidina es sintetizada por la bacteria Bacillus brevis y presenta actividad antimicrobiana frente a las bacterias Gram positivas (5). Es una molécula insoluble en agua (tiende a formar suspensiones coloidales), pero soluble en metanol, etanol, isopropanol, etilenglicol, acetona y formamida, lo cual es una desventaja a la hora de ser utilizada en sistemas biológicos. Por otro lado, las vesículas lipídicas (liposomas) han sido extensamente estudiadas como vehículos antimicrobianos debido a su capacidad única para transportar tanto sustancias lipofílicas como hidrofílicas, permitiendo que una amplia gama de compuestos pueda ser encapsulada. Mientras las moléculas hidrófilas pueden atraparse en el centro acuoso, las moléculas hidrófobas, tal como la gramicidina, se insertan en la bicapa de la membrana (6). Es por esto que el uso de los liposomas es una interesante alternativa para aumentar la biodisponibilidad y la solubilidad del péptido, mejorando así su utilización.Con el objetivo entonces de obtener un sistema antimicrobiano con mayor compatibilidad biológica y evitar la generación de bacterias resistentes, en este trabajo, se incorporó la gramicidina en la membrana lipídica de los liposomas (L-GRA) y se estudió su efecto bactericida sobre el crecimiento de bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus).MétodosPara la síntesis de los liposomas antimicrobianos, se utilizó una solución de DPPC, DMPC, gramicidina y colesterol (7:2:2:1) en cloroformo. Se dejó evaporar bajo una corriente de N2, formando un film lipídico (7), el cual se resuspendió en 1 ml de H2O. La suspensión de vesículas multilaminares resultante se extrudó consecutivamente a 50 °C a través de filtros de membranas de policarbonato con un tamaño de poro de 800 nm y 400 nm, con el objetivo de obtener liposomas monodispersos unilaminares.La presencia del péptido en los liposomas se determinó a través de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), mientras que la concentración de GRA y fosfolípidos se cuantificó por fluorescencia utilizando el kit ATTO-TAG CBQCA (Invitrogen) y a partir del método colorimétrico de Stewart, respectivamente. Luego, se evaluó la actividad de L-GRA frente a la bacteria Gram positiva (Staphylococcus aureus) en medio líquido Luria Bertani (LB). Para ello, se colocaron concentraciones decrecientes de L-GRA en medio LB, se inocularon con la bacteria y se incubaron durante 24 hs a 37 °C. Posteriormente, se observó la turbidez de las respectivas muestras determinando la concentración inhibidora mínima (CIM) y se sembraron en medio sólido para obtener la concentración mínima bactericida (CMB). Además, se cuantificó la actividad antimicrobiana a través del método de diluciones sucesivas. El mismo procedimiento se utilizó para estudiar la CIM y CMB a los 7 días.Resultados En primer lugar, se verificó la presencia del péptido en los liposomas comparando los espectros de FTIR correspondientes a los liposomas sin GRA, GRA y L-GRA. Habiendo demostrado la incorporación del péptido en las vesículas lipídicas y cuantificando la cantidad de gramicidina atrapada, se estableció una relación GRA/liposomas de aproximadamente igual a 4 x105 moléculas de péptido por liposoma. Por otro lado, se obtuvo una CIM de 0,12 mg/ml y una CMB de 0,24 mg/ml de L-GRA para las 24 horas, observando la misma actividad bactericida luego de 7 días.Conclusión La incorporación de la gramicidina a la membrana del liposoma permitió la vehiculización de este péptido en medios acuosos y de esta manera aumentar su biodisponiblidad y posiblemente mejorar la biocompatibilidad. Por otra parte, el sistema liposoma-gramicidina presentó una actividad antimicrobiana prolongada en el tiempo frente a la bacteria Gram positiva. En base a lo observado se puede concluir que el sistema liposoma-péptido resulta ser una opción prometedora en el campo de la biomedicina como alternativa frente a la utilización de los antibióticos tradicionales.