APLICACIÓN de polímeros inorgánicos en la preservación de cepas de INTERÉS biotecnológico

ALVAREZ, G.S; COPELLO, G.J; M. F. DESIMONE; DIAZ, L.E

Facultad de Ingenieria-Universidad Nacional de Mar del Plata

Congreso; TANAMAT 2007; 2007

Sociedad Argentina de Materiales

APLICACIÓN de polímeros inorgánicos en la preservación de cepas de INTERÉS biotecnológico. Alvarez g.(1), Copello G.(2), desimone M.(3), DiAZ l.(4) (1) (2) (3) (4) Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA. Junín 956 CABA, Buenos Aires, Argentina. e-mail: gialvarez@ffyb.uba.ar RESUMEN La preservación de células productoras de metabolitos de interés o simplemente de cepas utilizadas como referencia, es de gran importancia dentro de las ciencias biológicas. Los métodos actuales (liofilización y congelación a bajas temperaturas) no son efectivos para todos los casos y resultan costosos para muchas instituciones. En el presente trabajo se desarrolla un método alternativo de conservación y transporte de células mediante la incorporación de polímeros inorgánicos porosos, obtenidos a partir del proceso sol-gel. Se evalúa la importancia de los distintos catalizadores ácidos utilizados para lograr la gelificación del material polimérico, en relación a su biocompatibilidad. Los microorganismos encapsulados se someten previamente a situación de stress salino a fin de lograr una mayor supervivencia a bajos niveles de humedad (geles desecados).   Se presentan los resultados obtenidos para una cepa de E. coli productora de proteína recombinante por un período superior al año y medio con recuentos cercanos al 80 % del valor inicial. Palabras claves: sol-gel, encapsulamiento, preservación, E .coli. INTRODUCCIÓN La preservación de macromoléculas, células, tejidos e incluso órganos es un punto crítico dentro de las ciencias biomédicas, biotecnológicas y farmacéuticas.  Los microorganismos han sido y son extensamente utilizados en la obtención de alimentos, solventes y productos de interés farmacéutico como antibióticos, vitaminas o, más recientemente, proteínas recombinantes [1]. Esto ha derivado en la continua búsqueda de formas de conservar  aquellas cepas de microorganismos cuyas propiedades los hacen únicos. Se recomienda por lo menos la selección de dos métodos de conservación de cepas a fin de asegurar su viabilidad y recuperación. [2]      Los métodos de preservación no sólo deben garantizar la viabilidad a lo largo de los años en un número superior al 70% de la población inicial, sino también la pureza y estabilidad genética de las células. En la actualidad los métodos más utilizados incluyen la liofilización y  la congelación a bajas temperaturas (a –70° C y –196° C) mediante el uso de agentes crioprotectores. Estas técnicas garantizan, según la cepa, hasta 10 años de conservación aunque sus principales inconvenientes son: costo de los equipos utilizados y  pérdida de cepas congeladas por daños en los equipos o simplemente cortes de energía.      Por otro lado existen técnicas de conservación a mediano plazo, de 2 a 5 años, como  la desecación en diferentes soportes (arena, sílica gel, perlas de vidrio) o la conservación en parafina líquida.         En el presente trabajo proponemos el uso de silicato de sodio y dióxido de silicio (vía acuosa) como precursores de la síntesis de geles inorgánicos mediante los cuales preservar cepas bacterianas de interés biotecnológico. Al mismo tiempo, realizamos una comparación  de la sobrevida de E. coli conservada en geles obtenidos mediante catálisis ácida, utilizando tanto ácidos orgánicos como inorgánicos [3], almacenada a distintas temperaturas y en distintos estados fisiológicos (stress salino), por períodos superiores al año y medio desde su encapsulamiento en dichas matrices.       La estabilidad genética de la cepa utilizada será también motivo de análisis.   materiales y métodos Inmovilización con dióxido de silicio: 1 g de SiO2 fue disuelto en 4 ml de hidróxido de sodio 2 M e incubado a 80º C hasta obtener una suspensión coloidal. Esta suspensión fue luego acidificada a pH 6.5 con ácido cítrico 0.75 M o ácido clorhídrico 1 M. Una suspensión de 1.74x1013 UFC/ml de E. coli fue mezclada con igual volumen de la suspensión coloidal antes mencionada. La mezcla así obtenida fue dejada 2 minutos hasta gelificación. Inmovilización con silicato de sodio: 1 g de silicato de sodio fue disuelto en 6 ml de agua e incubado a 80º C hasta obtener una solución coloidal. El resto del procedimiento fue realizado como se menciona en el punto anterior aunque utilizando una suspensión bacteriana de 3.6x1011 UFC/ml. Inmovilización con tetraetoxisilano (TEOS): la solución fue preparada sonicando (35 kHz) una mezcla de 1 ml de TEOS, 0.2 ml de agua y 0.06 ml de ácido clorhídrico 0.04 M durante 30 minutos a 20º C.  Luego de la adición de 2 ml de agua se eliminó el exceso de etanol por corriente de nitrógeno. Una suspensión de 4.7x1013 UFC/ml fue mezclada con igual volumen de la solución de TEOS hidrolizado. Determinación de viabilidad: se realizaron diluciones al décimo en medio LB de la suspensión inicial de E. coli y de los geles, en los cuales se la conservaba, tras su ruptura por medios mecánicos. Se sembraron las diluciones en  LB agar. RESULTADOS        En las figuras 1 y 2  se observa la viabilidad de E. coli encapsulada en matrices de silicio a partir de dos precursores diferentes luego de un año y medio. Los recuentos son claramente superiores al utilizar ácidos orgánicos en el proceso de gelificación en lugar de ácido clorhídrico. La conservación a 4º C resulta satisfactoria manteniendo recuentos cercanos al 80% del valor inicial. Figura 1. Recuentos E. coli conservada a 4º C luego de un año y medio.   Figura 2. Recuentos E. coli conservada a 20º C luego de un año y medio. En todos los casos anteriores se impidió el envejecimiento- desecación  de los geles debido a que, en  experiencias anteriores, hemos observado muerte celular en geles con humedad inferior al 60%.  En este sentido, se realizó un ensayo destinado a lograr supervivencia a bajas humedades, ya que en este estado, las matrices presentan mayor resistencia mecánica y son más fáciles de transportar o manipular. El ensayo consistió en  someter a los cultivos celulares (previo encapsulamiento) a stress salino con el fin de lograr la síntesis de trehalosa (azúcar protector frente a la desecación) [4]. Además se utilizó trehalosa exógena y otros aditivos (glicerol, manitol) como posibles metabolitos protectores. Los encapsu-lamientos fueron realizados en TEOS ya que es ésta la matriz que más fácilmente puede desecarse conservando sus características. Figura 3. Efecto del proceso de encapsulamiento. Recuentos  a los 10 días. Figura 4. Supervivencia al año y medio post- encapsulamiento. DISCUSIÓN        La mayor viabilidad observada al utilizar ácido cítrico puede deberse  a su capacidad de actuar como metabolito protector o a que los microorganismos encapsulados lo utilicen como fuente de carbono [3]. El stress salino provo- cado a la bacteria previo a su encapsulamiento fue el único tratamiento efectivo en evitar la muerte de los microorga-nismos frente a la desecación de los geles, posiblemente debido a la síntesis de trehalosa. Esto también podría expli-car porque la bacteria logró sobrevivir en matrices de TEOS más allá de los 3 meses (máximo de viabilidad obtenido hasta el momento). Los polímeros de TEOS son por sí mismos más agresivos debido a la cinética de hidrólisis del alcóxido que continúa aún luego de la gelación.        Se demostró además que las bacterias encapsuladas conservan su identidad y continúan produciendo el metabo-lito de interés. Datos no presentados en este trabajo.[1] CONCLUSIÓN      Si bien el encapsulamiento de microorganismos en polí-meros  de silicio ha sido utilizado en varios trabajos de bio-catálisis y producción de metabolitos, no se contaba hasta el momento con datos de viabilidad a períodos de tiempo tan prolongados y no se había propuesto antes como método de preservación a temperaturas fáciles de mantener (4º C); por lo cual el presente trabajo abre la puerta hacia nuevas aplicaciones del encapsulamiento de células. AGRADECIMIENTOS G.S.A agradece a  la Agencia Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas por su beca doctoral. M.F.D agra-dece a CONICET por su beca post-doctoral. Los autores agradecen también el soporte brindado por la Universidad de Buenos Aires. REFERENCIAS 1.-Desimone M et al. (2005) Efficient preservation in a  silicon dioxide matrix of E. coli producer of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol 68: 747-752 2.-Weng Alemán Z et al. (2005) Conservación de microor-ganismos  Rev Cubana Higepidemiol 43(3). 3.-Alvarez G et al. (2007) Immobilization of bacteria in silica matrices using citric acid in the sol-gel process. Appl Microbiol Biotechnol 73:1059-1064. 4.-Welsh D et al. (1999) Osmotically induced intracellular trehalose, but not glycine betaine accumulation promotes desiccation tolerance in E. coli. Microbiol letters 174 57-63