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La enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3β-HSD) está involucrada en la síntesis de hormonas esteroidales con potente actividad anti-inflamatoria e inmunosupresora. Es la única enzima, en la vía suprarrenal, de síntesis de corticosteroides, que no es miembro de familia citocromo P450. También conocida como 5-delta 4-isomerasa, produce la conversión oxidativa de los 3β-hidroxi-D5-esteroides a la configuración 3-ceto-D4 y es por tanto, esencial para la biosíntesis de todas las clases de hormonas esteroidales. Cataliza la síntesis de progesterona a partir de pregnenolona, la 17-hidroxiprogesterona desde la 17-hidroxipregnenolona, y la androstenediona desde la dehidroepiandrosterona en la glándula suprarrenal.1El virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA), una cepa atenuada que deriva de la cepa parental CVA, posee en su genoma el gen A44L que codifica para una enzima con similitud a la 3β-HSD humana, generando de esta manera un estado anti-inflamatorio general que favorece la replicación y diseminación viral. Este vector viral posee características adecuadas, entre otras, como su alto potencial inmunogénico e inocuidad, que lo sitúan como uno de los mejores candidatos a ser utilizado como plataformas en el desarrollo de vacunas. Para aumentar aún más la inmunogenicidad de estos vectores, aquellos genes relacionados a la evasión de la respuesta inmune, como es el caso del A44L, son candidatos potenciales a ser eliminados. En particular en el presente trabajo se trabajó con un virus MVA con los genes A44L, A46R y C12L delecionados y se desarrolló un método analítico sensible y selectivo para la cuantificación de la actividad enzimática de la 3β-HSD viral, utilizando la cromatografía líquida asociada a la espectrometría de masas con tecnología de triple cuadrupolo y equipada con electrospray como método de ionización (LC / ESI/ MS-QQQ).