INHIBICION DE LA REPLICACIÓN IN VITRO DE ADENOVIRUS Y ARENAVIRUS POR DERIVADOS SINTÉTICOS DE ESTEROIDES DE ORIGEN ANIMAL.

CARINA ROMANUTTI; ELIANA ACOSTA; ANDREA BRUTTOMESSO; JUAN BISCEGLIA; VIVIANA CASTILLA; MÓNICA WACHSMAN; LYDIA GALAGOVSKY

San Luis, Argentina

Congreso; XXVI CONGRESOARGENTINO DE QUÍMICA; 2006

Asociación Química Argentina

INHIBICION DE LA REPLICACIÓN IN VITRO DE ADENOVIRUS Y ARENAVIRUS POR DERIVADOS SINTÉTICOS DE ESTEROIDES DE ORIGEN ANIMAL <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> Carina Romanutti1, Eliana Acosta1, Andrea Bruttomesso2, Juan Bisceglia2, Viviana Castilla1, Mónica Wachsman1 y Lydia Galagovsky2 <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> 1 Laboratorio de Virología. Departamento de Química Biológica y 2 Departamento de Química Orgánica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Email: lyrgala@qo.fcen.uba.ar <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> Introducción La clave de la quimioterapia antiviral consiste en encontrar una droga lo suficientemente específica como para inhibir el ciclo de multiplicación de un virus sin afectar el normal funcionamiento celular. Debido a la interacción tan cercana entre la replicación viral y el metabolismo celular, resulta evidente dirigir la búsqueda a hacia nuevas drogas que afecten eventos específicamente virales o controlados por enzimas codificadas por el virus que difieren estructural y funcionalmente de las enzimas celulares. Los adenovirus (ADV) pertenecen a la familia Adenoviridae. Son virus con genoma ADN lineal, doble cadena, sin envoltura y de simetría icosaédrica. Los ADV son causantes de conjuntivitis en humanos e infecciones en el tracto respiratorio inferior en niños menores de 5 años. Por lo general infectan a sus huéspedes a través de las mucosas ocular, faríngea o intestinal. Existen en Argentina 3 tipos de infecciones oculares por ADV, altamente contagiosas y asociadas a epidemias (8). Son el segundo patógeno viral de importancia en el país, después del virus respiratorio sincicial, en las infecciones del tracto respiratorio inferior. La familia Arenaviridae comprende un grupo de virus envueltos  con genoma RNA, que se distinguen por la presencia de ribosomas celulares en el interior de los viriones. Los miembros de esta familia se caracterizan por producir infecciones persistentes en roedores, que actúan como reservorios naturales, pudiendo transmitir la infección al hombre. El arenavirus Junín (JUNV) es el agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), enfermedad endémica en la pampa húmeda que se caracteriza por alteraciones hematológicas, renales, neurológicas, cardiovasculares e inmunológicas, con una tasa de mortalidad de aproximadamente 15-20% (2). El único compuesto cuya eficacia se ha evaluado en pacientes con FHA es la ribavirina. Este compuesto, demostró no ser efectivo en la disminución de la mortalidad presentando además efectos colaterales adversos (4). Dado que en la actualidad no existe una terapia antiviral tópica o sistémica efectiva contra estos virus, la búsqueda de antivirales contra ADV y JUNV es una preocupación constante y resulta de suma importancia el desarrollo de compuestos con capacidad de inhibir la replicación viral in vitro y su posterior ensayo en condiciones in-vivo. En este trabajo hemos estudiado la actividad citototóxica y antiviral de compuestos obtenidos por síntesis química a partir de esteroides de origen animal, frente a los virus ADV tipo5 y JUNV cepa XJCl3. Los compuestos polioxigenados probados corresponden a derivados de 19 átomos de carbono, obtenidos por síntesis a partir de los esteroides de mamíferos dehidroepiandrosterona (DHEA) o de la epiandrosterona (EA). La DHEA es una de las hormonas esteroidales más abundantes en el torrente sanguíneo producida por la glándula adrenal. Se ha demostrado que DHEA presenta una gran variedad de actividades biológicas tales como: actividad antitumoral, reducción de las complicaciones del envejecimiento, prevención de la diabetes y del estrés, así como actividad antiviral frente a retrovirus y flavivirus (1,6). La utilidad clínica de esta hormona como tal presenta una fuerte limitación ya que, primero, para observar la mayor parte de estos efectos fisiológicos es necesario administrar una gran dosis de este esteroide y, segundo, que la conversión metabólica de la DHEA en hormonas sexuales conlleva a numerosos efectos secundarios. Se cree, por otra parte, que la variedad de respuestas inducidas por la DHEA se debería, en realidad, a la existencia de diferentes derivados metabólicos específicos, sintetizados en tejidos determinados (5,7,9). Debido a esto, existe gran interés en la síntesis de análogos de DHEA, y en la búsqueda de sus posibles actividades biológicas específicas. Sumado a lo anterior, la eficacia de ciertos análogos sintéticos de esteroides de origen vegetal (10-12) como inhibidores de la multiplicación de diferentes virus de importancia clínica amerita la investigación de este tipo de compuestos esteroidales como potenciales agentes antivirales. <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> Metodología La concentración citotóxica 50 o concentración de compuesto que reduce la viabilidad celular en un 50 % (CC50) se determinó utilizando el método colorimétrico del MTT en cultivos confluentes de células Vero y A549 (3). La concentración efectiva 50 o concentración de compuesto requerida para inhibir la multiplicación viral en un 50 % (CE50) se calculó por el método de reducción del rendimiento viral, cuantificando la producción de virus por el método de placas. Con el cociente de estos valores se determinó el índice de selectividad (IS). El efecto directo de los compuestos más activos sobre la partícula viral se analizó mediante un ensayo de actividad virucida. Para ello, alícuotas de los stocks virales se incubaron en ausencia de células con los derivados a ensayar, cuantificándose luego la infectividad remanente de las muestras por el método de placas. <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> Resultados Los compuestos DHEA (3b-hidroxiandrost-5-en-17-ona) y EA  (3b-hidroxi-5a-androstan-17-ona) presentaron actividad antiviral frente a ambos virus con IS de 62,5 y 83,2 para ADV respectivamente y para JUNV de >30 y >83 respectivamente. El ensayo de citotoxicidad mostró que los derivados sintéticos con un grupo acetato en el C3 presentan una disminución en el valor de la CC50 de entre 10 y 20 veces dependiendo del sistema celular utilizado. La presencia de un acetato adicional en el C16b no influye significativamente en la citotoxicidad en comparación con los compuestos de partida; en cambio, se produce una diminución de entre 3 y 5 veces del valor de la CC50, cuando se introduce un grupo acetato en la posición C-16a. De los derivados ensayados los más activos frente a ADV y JUNV fueron: el diacetato de 17-oxo-5a-androstan-3b,16a-diilo y el 17-etilendioxiandrostan-5,15-dien-3b-ol con IS de 21,5 y 23,1 para ADV y >21 y 121 para JUNV. Por otra parte los compuestos 3b,6a-dihidroxi-17-androstanona y el 3b-hidroxi-5a-androst-15-en-17-ona también resultaron activos frente a ADV con IS de 17,8 y 41,8 respectivamente. Por otra parte se comprobó que los compuestos DHEA y EA no presentan actividad virucida, es decir no producen la inactivación directa de las partículas virales. <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> Conclusiones  Los resultados obtenidos demuestran que tanto los compuestos de partida como algunos derivados exhiben una actividad antiviral significativa frente a los virus ensayados. Dicha actividad no es consecuencia de un efecto deletéreo sobre la partícula viral sino de la acción inhibitoria de estos compuestos sobre la replicación del virus en la célula infectada. La continuación de estos estudios de relación estructura-actividad con nuevos derivados sintéticos permitirá profundizar el conocimiento sobre la influencia de distintos sustituyentes para detectar aquellos que incrementen la actividad antiviral y disminuyan su citotoxicidad. <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> Bibliografía <!--[if !supportEmptyParas]--> <!--[endif]--> 1- Chang C, Ou Y, Raung S, Chen C (2005). J Gen Virol 86: 2513-2523. 2- Damonte EB and Coto CE (2002). Adv Virus Res 58: 125-155. 3- Denizot F and Lang R (1986) J Immunol Methods 89:271-277 4- Enría DA, Briggiler AM, Levis S, Vallejos D, Maiztegui LI, Canónico PG (1987). Antiviral Res 7: 353-359. 5- Lavalle B., Provost P, Roy R. (1996) J. Endocrinol., 150: S119. 6- Loria RM, Inge TH, Cook SS, Szakal AK, Regelson W (1988). J. Med. Virol. 26: 301-314. 7- Mohan P. F., Cleary M. (1992). Steroids, 57:,244. 8- Romanowski EG and Gordon YJ (2000). IOVS 41: 460-463. 9- Straub R. 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