Aislamiento, secuenciación y caracterización del peptidoma de las secreciones de la piel de dos especies de Hypsiboas (Anura, Hylidae, Hylinae)

BRUNETTI ANDRÉS E.; MARANI MARIELA M.; GONZALEZ RODRIGO; CAMPERI SILVIA A.; FAIVOVICH JULIÁN; CABRERA GABRIELA M.

Los Cocos, Córdoba

Congreso; I Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2012

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

Las secreciones producidas por las glándulas serosas de la piel de anfibios contienen péptidos con un amplio espectro de actividad antibacterial y antifúngica. Éstos constituyen la primera barrera del sistema de inmunidad innata que defiende al animal contra la invasión de microorganismos patógenos y pueden actuar como una forma de protección frente a sus predadores. Estas moléculas presentan un gran potencial para el desarrollo de agentes antimicrobianos de uso terapéutico contra microorganismos resistentes. Su estudio es también de interés para el conocimiento de la biología de las especies que los sintetizan, la evolución del sistema inmune en anuros, y en algunos casos, como fuente de información con valor taxonómico para ayudar a comprender la historia evolutiva de las diferentes familias de ranas. El objetivo del presente trabajo fue el aislamiento, identificación y secuenciación de los péptidos presentes en las secreciones de la piel de dos especies del género Hypsiboas y la posterior síntesis química y caracterización de su actividad antimicrobiana. Se colectaron individuos adultos de ambos sexos de Hypsiboas pulchellus e H. punctatus durante el verano de los años 2010, 2011 y 2012 en las localidades de Ibicuy (Entre Ríos) y Santa Fe (Santa Fe) Argentina, respectivamente. Las secreciones fueron obtenidas mediante estimulación eléctrica transcutánea(1). El extracto crudo fue separado y analizado mediante HPLC-EM utilizando dos tipos de columna: C18 o PFP, e ionizado mediante ESI. La secuencias de novo se obtuvieron por interpretación manual de los espectros MS/MS generados mediante un analizador hibrido cuadrupolo-tiempo de vuelo, MicrOTOF Q II de Bruker. Algunos péptidos fueron sintetizados en fase sólida empleando la química Fmoc, y sus espectros EM/EM fueron comparados con los de los compuestos naturales. La actividad antimicrobiana fue evaluada frente a Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213. Se identificaron y secuenciaron 18 péptidos de cadena corta (6-14 residuos) en H. pulchellus y 13 en H. punctatus, con el extremo C terminal en forma de ácido o en forma de amida. No se encontraron diferencias entre sexos en cuanto a la composición peptídica de ambas especies, pero sí en cuanto a la intensidad de algunos de ellos en H. pulchellus. Al comparar entre años, se evidenció variación en la presencia/ausencia de tres péptidos de H. pulchellus y de uno solo en H. punctatus. La búsqueda en base de datos muestra que en todos los casos se tratan de secuencias nuevas. De los 31 péptidos secuenciados, solo tres de ellos (secretados por H. punctatus) son comparables a algunos de los disponibles en base de datos; uno, con una similitud del 92% con Hsp-1 de una población de Brasil de esta misma especie(2), y otros dos, con similitudes del 83 y 75%, con la porción madura del péptido Rsp-1 de H. raniceps(3). Se está trabajando en la identidad de los aminoácidos Leu/Ile, no diferenciables mediante EM/EM.   (1)     Tyler MJ, Stone DJM, Bowie JH. 1992. J Pharm Tox Met 28(4):199-200 (2)     Prates MV, ML Sforça, Regis WCB, Leite JRSA, Silva LP, Pertinhez TA, Araújo ALT, Azevedo RB, Spisni A, Bloch C Jr. 2004. J Biol Chem 279 (13):13018-13026. (3)     Magalhães BS, Melo JA, Leite JR, Silva LP, Prates MV, Vinecky F, Barbosa EA, Verly RM, Mehta A, Nicoli JR, Bemquerer MP, Andrade AC. 2008. Biochem Biophys Res Commun. 377(4):1057-61.