Mecanismos de recuperación de membrana que operan en células cromafines ante exocitosis masiva

ANDR¨¦S P¨¦REZ BAY; FERNANDO D. MARENGO

Huerta Grande, C¨®rdoba.

Taller; VIII Taller Argentino de Neurociencias; 2006

Taller Argentino de Neurociencias

Luego de la exocitosis, las neuronas y c¨¦lulas neuroend¨®crinas tiene que recuperar el exceso de membrana y rellenar los "pools" de ves¨ªculas deplecionados. Para lograrlo, se ponen en juego diferentes mecanismos endocit¨®ticos. Este trabajo intenta caracterizar los mecanismos endocit¨®ticos y de ciclado de membrana  activados por diversos est¨ªmulos que generan exocitosis masiva, para lo que se utilizaron t¨¦cnicas de im¨¢genes y marcadores fluorescentes como FM 1-43 y dextranos. Cuando se estimul¨® con K+ 50mM m¨¢s Ca2+ 2mM durante 0.5 a 7 min se evidenciaron dos componentes endocit¨®ticos: uno r¨¢pido sensible a inhibidores de PKC que se completa a los 30 seg de iniciado el est¨ªmulo y que sobrecompensa a la exocytosis; y otro lento que aparece 1,5 a 2,5 min despu¨¦s y que compensa completamente a la exocitosis. A pesar de que la endocitosis recupera la totalidad de la membrana exocitada, s¨®lo una fracci¨®n de la misma vuelve a ser liberada cuando se aplica un segundo est¨ªmulo 30-80 min despu¨¦s. La aplicaci¨®n de est¨ªmulos m¨¢s fisiol¨®gicos (nicotina 50-200¦ÌM o acetilcolina 0.2-1mM por 1-5 min) gener¨® una menor exocytosis, que fue totalmente compensada por endocitosis, y es de remarcar que toda la membrana recuperada en estas condiciones se libero durante el segundo est¨ªmulo. De manera similar, al aplicar K+ 50mM m¨¢s Ca2+ 0,5mM (en vez de 2mM) la exocitosis tambi¨¦n fue moderada y la mayor parte de  la membrana endocitada pudo ser liberada con la segunda despolarizaci¨®n. Esto sugiere que en c¨¦lulas cromafines existe un mecanismo de reciclado r¨¢pido vesicular que es capaz recuperar una cantidad de ves¨ªculas equivalente al 20% de la membrana en menos de 30-60 min. Por otro lado, est¨ªmulos muy intensos (como K+ 50mM m¨¢s Ca2+ 2mM) disparan un mecanismo endocit¨®tico adicional, que contribuye al mantenimiento de la homeostasis de membrana, pero que no genera ves¨ªculas liberables en el marco temporal de nuestros experimentos. La distribuci¨®n de fluorescencia en c¨¦lulas marcadas con dextranos de 40 KD sugiere que este ¨²ltimo mecanismo generar¨ªa estructuras grandes, como cisternas y vacuolas. En concordancia con esta hip¨®tesis, LY-294002  que bloquea endocitosis tipo "bulk" en c¨¦lulas bipolares (Holt et al, 2003), inhibi¨® parcialmente la endocitosis y bloque¨® totalmente la aparici¨®n de la fracci¨®n no liberable.