Expresión de la proteína recombinante codificada por el gen Tc00.1047053511071.140 de Trypanosoma cruzi

MARIA ELISA LOMBARDO; PUENTE, VANESA ROCÍO; ESTEBAN BONTEMPI

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XXXII REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTIA DE PROTOZOOLOGIA; 2020

Trypanosoma cruzi, el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, es un parásitohemodeficiente debido a que no es capaz de completar la síntesis de hemo. Sin embargo, ladetección de ácido 5-aminolevúlico (ALA) en el medio de cultivo y la actividad de hemosintetasa (Hemo- S) en epimastigotes de T. cruzi, avalarían la funcionalidad de la primera yla última de las enzimas involucradas en la biosíntesis de hemo, ALA sintetasa (ALA-S) yHemo-S respectivamente. Estos reportes, sumado a evidencias obtenidas en Leishmaniaspp y Crithidia fasciculata (Identificación de genes homólogos a las 3 últimas enzimas delcamino metabólico del hemo, detección de actividad de ALA-S en promastigotes), nosllevaron a emplear la base de datos GenDB con la cual se realizó una búsqueda avanzadade zonas del genoma del parásito que homologuen con buen score con la secuencias de lasenzimas involucradas en la síntesis del hemo. Se encontraron dos secuencias nucleotídicashomólogas: Tc00.1047053511899.40 y Tc00.1047053511071.140, que podrían codificarpara una proteína con actividad de ALA-S [Succinil-CoA + Glicina → ALA + CoA + CO2]o 2-amino-3-cetobutirato-CoenzimaA Ligasa (KBL) [Acetil CoA + Glicina → aminoacetona +CoA + CO2]. Luego de clonar esta secuencia y sobreexpresarla en un modelo bacteriano,procedimos a la purificación de la proteína recombinante. La etiqueta de polihistidina que leaporta el plásmido de expresión (pET22) permitió purificarla por cromatografía de afinidad,empleando una columna con Ni2 inmovilizado, y detectarla por el ensayo de dotblot con unanticuerpo anti His. Empleando la proteína purificada se midió actividad de ALA-S y KBL, enensayos de competencia por sustratos Succinil CoA/Acetil CoA. En condiciones desaturación con succinil CoA la proteína no fue capaz de sintetizar aminoacetona.Concluimos que la proteína codificada Tc00.1047053511071.140 correspondería a unaenzima con actividad ALA-S, avalando la presencia de ALA en cultivos del parásito