Terapia Fotodinámica basada en ALA en Esferoides de células de Adenocarcinoma de Pulmón.

TEIJO M J; DIEZ B; BATLLE A; FUKUDA H

Buenos Aires, Argentina

Jornada; XXVI Jornadas Nacionales de Oncología del Instituto "Ángel H. Roffo".; 2010

INSTITUTO “ÁNGEL H. ROFFO”

El cultivo de células en esferoides multicelulares (EMCs) representa un modelo in vitro tridimensional y avascular de tumores sólidos, útil para el estudio de distintas terapias antitumorales. La terapia fotodinámica (TFD) es una modalidad relativamente nueva para el tratamiento de tumores superficiales, obstructivos y endoscópicamente accesibles. Consiste en la administración de un fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido tumoral. La irradiación posterior con luz de longitud de onda adecuada induce la generación fotoquímica de especies reactivas de oxígeno que llevan eventualmente a la muerte celular. Las porfirinas son los únicos FS sintetizados endógenamente mediante la incubación con su precursor biológico: el ácido 5-aminolevúlico (ALA), siendo la Protoporfirina IX (PpIX) el producto principal. El modelo de EMCs es apropiado para el estudio de muerte celular post-TFD dado que simula las condiciones de microtumores independientemente de la vasculatura, cuyo rol en la erradicación de tumores por TFD es controversial. En el presente trabajo se reporta la puesta a punto de las condiciones adecuadas para el cultivo de esferoides en la línea A549 de adenocarcinoma de pulmón humano y se caracteriza la respuesta de síntesis de porfirinas y viabilidad post-TFD en las conformaciones bi y tridimensional del cultivo. Las células se sembraron a una densidad de 5x104 células /ml de MEM+5% SFB, sobre un colchón de agar 3%-RPMI (1:1). Se incubaron en estufa a 37°C con atmósfera de 5% CO2 y cada 48 hs, se reemplazaron dos tercios del medio de cultivo. Al cabo de 7 días, los esferoides obtenidos presentaron en promedio 1866 ± 195 células. Se incubaron las células con distintas concentraciones de ALA durante diferentes tiempos, y se estudió la acumulación de porfirinas mediante una extracción química con HCl 5% y cuantificación espectrofluorométrica. En la capa externa de los esferoides la acumulación de porfirinas se evidenció por microscopía de fluorescencia. En el cultivo en monocapa se llegó a un plateau en la síntesis de porfirinas a una concentración de ALA 0,5mM, mientras que en el cultivo en esferoides la misma se obtuvo con ALA 1mM. A plazos cortos (3hs) se observó que el aumento de la síntesis de porfirinas en función del tiempo de incubación, es similar para ambos tipos de cultivo, pero a tiempos largos (16hs) la cinética de síntesis en la monocapa es más rápida que en los esferoides, (0,41±0,01 pg porf./cél monocapa ; 0,28±0,10 pg porf./cél esferoides). Al cabo de una incubación de 1h con ALA 1mM, las células fueron irradiadas con un banco de 2 tubos fluorescentes por distintos tiempos. Luego de 1h se analizó, tanto en la monocapa como en los esferoides, la viabilidad celular por el método de MTT y la muerte celular por tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio, Las curvas de supervivencia post-TFD en esferoides mostraron un ligero corrimiento (2 min) de la dosis lumínica que produce un 50% de muerte celular (DL50) y una mayor supervivencia de células en esferoides (31,9±8,7%) respecto de la monocapa (9,3±0,8%) para una irradiación de 20 min. Estos resultados permiten inferir que si bien la síntesis de porfirinas en los esferoides es del mismo orden que en la monocapa, la accesibilidad de la luz a las células del interior del esferoide es un factor limitante para la efectividad de la terapia en este modelo de conformación tridimensional propia de los tumores. in vitro tridimensional y avascular de tumores sólidos, útil para el estudio de distintas terapias antitumorales. La terapia fotodinámica (TFD) es una modalidad relativamente nueva para el tratamiento de tumores superficiales, obstructivos y endoscópicamente accesibles. Consiste en la administración de un fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido tumoral. La irradiación posterior con luz de longitud de onda adecuada induce la generación fotoquímica de especies reactivas de oxígeno que llevan eventualmente a la muerte celular. Las porfirinas son los únicos FS sintetizados endógenamente mediante la incubación con su precursor biológico: el ácido 5-aminolevúlico (ALA), siendo la Protoporfirina IX (PpIX) el producto principal. El modelo de EMCs es apropiado para el estudio de muerte celular post-TFD dado que simula las condiciones de microtumores independientemente de la vasculatura, cuyo rol en la erradicación de tumores por TFD es controversial. En el presente trabajo se reporta la puesta a punto de las condiciones adecuadas para el cultivo de esferoides en la línea A549 de adenocarcinoma de pulmón humano y se caracteriza la respuesta de síntesis de porfirinas y viabilidad post-TFD en las conformaciones bi y tridimensional del cultivo. Las células se sembraron a una densidad de 5x104 células /ml de MEM+5% SFB, sobre un colchón de agar 3%-RPMI (1:1). Se incubaron en estufa a 37°C con atmósfera de 5% CO2 y cada 48 hs, se reemplazaron dos tercios del medio de cultivo. Al cabo de 7 días, los esferoides obtenidos presentaron en promedio 1866 ± 195 células. Se incubaron las células con distintas concentraciones de ALA durante diferentes tiempos, y se estudió la acumulación de porfirinas mediante una extracción química con HCl 5% y cuantificación espectrofluorométrica. En la capa externa de los esferoides la acumulación de porfirinas se evidenció por microscopía de fluorescencia. En el cultivo en monocapa se llegó a un plateau en la síntesis de porfirinas a una concentración de ALA 0,5mM, mientras que en el cultivo en esferoides la misma se obtuvo con ALA 1mM. A plazos cortos (3hs) se observó que el aumento de la síntesis de porfirinas en función del tiempo de incubación, es similar para ambos tipos de cultivo, pero a tiempos largos (16hs) la cinética de síntesis en la monocapa es más rápida que en los esferoides, (0,41±0,01 pg porf./cél monocapa ; 0,28±0,10 pg porf./cél esferoides). Al cabo de una incubación de 1h con ALA 1mM, las células fueron irradiadas con un banco de 2 tubos fluorescentes por distintos tiempos. Luego de 1h se analizó, tanto en la monocapa como en los esferoides, la viabilidad celular por el método de MTT y la muerte celular por tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio, Las curvas de supervivencia post-TFD en esferoides mostraron un ligero corrimiento (2 min) de la dosis lumínica que produce un 50% de muerte celular (DL50) y una mayor supervivencia de células en esferoides (31,9±8,7%) respecto de la monocapa (9,3±0,8%) para una irradiación de 20 min. Estos resultados permiten inferir que si bien la síntesis de porfirinas en los esferoides es del mismo orden que en la monocapa, la accesibilidad de la luz a las células del interior del esferoide es un factor limitante para la efectividad de la terapia en este modelo de conformación tridimensional propia de los tumores.