Incorporación de insulina en mitocondrias. Su transporte

PASSICOT GA; CAMBEROS MC; CAO G; CRESTO JC

Buenos Aires

Congreso; Congreso Argentino de Diabetes; 2008

Sociedad Argentina de Diabetes (SAD)

La insulina regula la síntesis y actividad de varias enzimas mitocondriales  importantes y controla el transporte de substratos oxidables sugiriendo que la mitocondria es una organela insulino-dependiente. Nosotros demostramos que la enzima degradante de insulina (EDI) se encuentra en la matriz mitocondrial (MM). Objetivos - Determinar si EDI facilita la incorporación mitocondrial de insulina. Métodos - EDI se obtuvo de músculo de rata por sucesivos pasos cromatográficos. Las mitocondrias hepáticas fueron aisladas según Parson y cols., recuperadas e incubadas a distintos tiempos a 25ºC con  oxígeno 100% e insulina (insulina fría: 1 ng/tubo, 125I-insulina de alta actividad específica: 105 c/m). De acuerdo al diseño experimental se agregaron EDI, substratos o inhibidores. La reacción fue detenida con 2 mM de N-etilmaleimida. La MM fue aislada por digestión con digitonina y el transporte y la degradación de insulina se determinaron por cromatografía, electroforesis en SDS-PAGE, inmunoblot y autorradiografía. Resultados - La contaminación peroxisomal y citoplasmática en MM no tiene relevancia y la microscopía electrónica demuestra que las mitocondrias obtenidas no presentan alteraciones estructurales. A 25ºC la insulina degradada fue: (pg/seg/mg prot), control: 0.87; EDI: 0.88, indicando que se debe a proteasas mitocondriales y no a la actividad de la enzima. EDI incrementa la incorporación a MM de insulina en forma dosis/dependiente (EDI µg/t, % incorporación, 60 seg; EDI 0: 1.46%, EDI 1.8: 2.04; P<0.02, n:4). El dinitrofenol (1 mM, desacoplante mitocondrial) y la bacitracina (1 mg/ml, competidor de la insulina en EDI) disminuyen la incorporación de EDI y el vanadato (50 µM, un inhibidor de ATPasas y fosfatasas) y succinato + ADP (5 mM, substratos de la respiración celular) no lo modifican. Perfiles cromatográficos de mitoplastos solubilizados con Triton X100 demostraron que el agregado de EDI forma un complejo que transporta insulina, que al ser disociado demuestra que la insulina es transportada. Las autorradiografías con material marcado confirmaron esta observación.   Conclusiones - 1) EDI facilita la incorporación mitocondrial de insulina a través de los transportadores específicos (TOM y TIM) que utiliza la enzima para su incorporación mitocondrial. 2) La insulina es transportada dentro de la enzima sin conocimiento mitocondrial (ausencia de señal para la incorporación mitocondrial). 3) EDI realiza un transporte activo de insulina.