DESARROLLO DE UNA VACUNA RECOMBINANTE CONTRA LA DIARREA VIRAL BOVINA INDUCTORA DE RESPUESTA INMUNE HUMORAL Y CELULAR

FRANCO, OLGA; OGAS CASTELLS, LORENA; LA TORRE, JOSÉ; SEKI, CRISTINA; COMBESSIES, GUSTAVO; GRIGERA, PABLO; CAPOZZO, ALEJANDRA

Mar del Plata, Argentina

Jornada; Jornadas Internacionales de Veterinaria Pràctica; 2009

Colegio de Veterinarios de la provincia de Buenos Aires

INTRODUCCIÓN Una vacuna que efectiva contra BVDV, debe ser capaz de inducir una respuesta inmune tanto humoral como celular en el animal, por un tiempo prolongado y sin provocar efectos adversos. Esto puede lograrse utilizando un antígeno específico altamente inmunogénico junto con un adyuvante que permita hacer más efectiva la modulación de la respuesta. En la Republica Argentina se utilizan vacunas inactivadas. La principal ventaja de este tipo de vacunas es que minimizan el riesgo de infección, ya que no son inmunosupresoras para el animal vacunado y se pueden aplicar en hembras gestantes. La desventaja, es que modulan una débil respuesta de anticuerpos neutralizantes y por lo tanto la duración de la protección es corta, lo cual indica la necesidad de aumentar la frecuencia de administración. El desarrollo de vacunas a subunidades es ventajoso en términos de bioseguridad y simplicidad en la formulación. Posee las ventajas de las vacunas inactivadas sumadas a la posibilidad de inmunomodular adecuadamente la respuesta. Se ha demostrado que la transmisión del virus puede ser bloqueada por la presencia de anticuerpos neutralizantes contra la glicoproteína E2 presente en la envoltura del virus. Siendo E2 el blanco principal de la respuesta neutralizante en BVDV, constituye el candidato para ser utilizado como antígeno en una vacuna recombinante. El objetivo de este trabajo es evaluar vacunas formuladas con la proteína E2 en su forma deletada producida en el sistema Baculovirus recombinante como antígeno vacunal, combinada con diferentes adyuvantes, en el modelo murino. Este modelo permite estudiar detallada y simultáneamente variedad de formulaciones en cuanto a su capacidad de inducir respuesta humoral; medida en niveles totales de anticuerpos, subclases y avidez; y respuesta celular, producción de gamma interferón y linfoproliferación. Este estudio ha permitido seleccionar la formulación candidata para ser evaluada en bovinos. MATERIALES Y MÉTODOS Células SF9 cultivadas en medio TNMFH +10% SFB, fueron infectadas con un Baculovirus recombinante que expresa dE2. Se cosechó el sobrenadante mediante centrifugación y se cuantificaron los dímeros de dE2 por SDS-PAGE Western Blot. Se utilizaron 48 Ratones BALB/c (hembras de 6 semanas de edad al inicio del experimento) distribuidos en los siguientes grupos experimentales: G1 (n=11): 1ug dE2 + 50 ul Adyuvante Completo de Freund (FCA), G2 (n=5): 1ug dE2 + 50 ul Marcol Montanide (Adyuvante Oleoso), G3 (n=5): 1ug dE2 + 50 ul de Aluminio, G4 (n=5): 1ug dE2 + 50 ul ISCOMs (Isconova®), G5 (n=5): 0,1ug dE2 + 50 ul ISCOMs, G6 (n=6): 0,01ug dE2 + 50 ul ISCOMs, G7 (n=5): sobrenadante cultivo SF9 Baculovirus heterólogo + 50 ul de PBS. Las vacunas oleosas se aplicaron por vía intra-peritoneal mientras que las acuosas se administraron por vía sub-cutánea.  Se tomaron muestras de suero los días 0, 15, 28 y 42 post primera inmunización para medición de seroneutralización, IgG total, avidez de la IgG, IgG1 e IgG2a utilizando técnicas de ELISA. A los 42 días post vacunación los animales fueron sacrificados y se extrajeron células de bazo para medir producción de IFN gamma y linfoproliferación por incorporación de timidina [3H]. RESULTADOS Todos los grupos mostraron seroconversión frente a BVDV luego de la primera dosis. Los niveles de IgG se incrementaron con la segunda dosis. En cuanto a la calidad de la respuesta, todas las vacunas fueron capaces de inducir altos títulos de IgG1, pero solo los grupos vacunados con adyuvante de Freund, Oleoso e ISCOMs con 1 ug de dE2 presentaron también un alto titulo de IgG2a. La utilización de ISCOMs logra estimular la producción de IgG1 independientemente de la dosis de antígeno, pero se observa que el título de IgG2a se incrementa en función de la dosis de antígeno aplicada. La vacuna formulada con hidróxido de aluminio estimuló preferencialmente la producción de IgG1, con bajos niveles de IgG2a, lo cuál se asocia a un perfil Th2. Esta tendencia polarizada en la respuesta se vio apoyada también la baja capacidad de esta vacuna de inducir inmunidad celular.  Para los otros grupos, la producción de IFN gamma junto con inducción de altos niveles séricos de IgG2a, y linfoproliferación sugiere una respuesta equilibrada, tanto humoral como celular.   Los esplenocitos provenientes de los animales inmunizados con las vacunas formulada con FCA, adyuvante oleoso e ISCOMs (1ug dE2) fueron capaces de inducir niveles de IFN-gamma significativamente superiores al grupo control (p<0,05), y buenos niveles de linfoproliferación, excepto la vacuna formulada con adyuvante oleoso. CONCLUSIONES y DISCUSIÓN En este modelo preliminar (murino) se demostró que la aplicación de vacunas que se formulan con proteína E2 como antígeno en conjunto con adyuvantes como FCA, Oleoso e ISCOMs, produce una buena respuesta equilibrada, tanto humoral como celular. La capacidad de inducir respuesta celular está relacionada con la prolongación en el tiempo de la protección del animal vacunado y suele ser difícil de inducir con las vacunas actualmente utilizadas.   El uso de la proteína viral E2 para la formulación de la vacuna y no del virus completo, le confiere a la vacuna una mayor seguridad para su producción y aplicación a campo. Por otro lado este acercamiento puede representar una herramienta útil en campañas de erradicación de BVDV, ya que permitiría diferenciar entre animales vacunados de infectados. La infección natural da lugar a anticuerpos contra otras proteínas virales, como NS3 y existen numerosos tests comerciales para medir serología contra esta proteína. En cuanto a los adyuvantes, la utilización de ISCOMs indujo una respuesta Th1 –Th2 equilibrada incluso a menores dosis de antígeno. Este adyuvante es acuoso, fácil de formular y aplicar, y no produce efectos secundarios.   Como paso siguiente en este estudio, se propone utilizar la proteína E2 de BVDV en su forma deletada en conjunto con ISCOMs para promover una adecuada respuesta inmune humoral y celular en bovinos. BIBLIOGRAFÍA THOMAS C, Young NJ, Heaney J, Collins ME, Brownlie J. Evaluation of efficacy of mammalian and baculovirus expressed E2 subunit vaccine candidates to bovine viral diarrhoea virus. Vaccine. (2009) 27(17): 2387-93. KAMSTRUP, S., Roensholt L., Jensen MH., Dalsgaard K. Production of a highly immunogenic subunit ISCOM vaccine against Bovine Viral Diarrhea Virus. Vaccine. (1999) 17(9-10):1057-64. KALAYCIOGLU A.T. Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) diversity and vaccination. A review. Vet Q. (2007). 29(2): 60-7. Nota: Este Proyecto fue financiado en forma conjunta por la Agencia de Ciencia y Tecnología SECyT, CONICET y Tecnovax S.A. a través del PID 2006 No. 35468. Título: “Inmunógenos de última generación contra virus de impacto veterinario” (FONCyT – Tecnovax S.A.)