Modificaciones puntuales en el ectodominio de la proteína M2 de influenza para la evaluación de vacunas universales

NORA MATTION; WALTER SPERAT; LORENA ITATI IBAÑEZ; JOSE MANUEL GOMEZ

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Jornada; VIII JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES; 2018

Facultad de Veterinaria (UBA)

El virus de influenza causa infecciones epidémicas en el hombre, las aves y diversas especies de animales susceptibles. El virus evoluciona continuamente mediante intercambio de segmentos genómicos o por incorporación de mutaciones en las proteínas de superficie contra las cuales se dirige la respuesta inmune evocada por las vacunas convencionales. Por lo tanto las vacunas deben ser actualizadas anualmente. Una estrategia para superar esta dificultad consiste en dirigir la respuesta inmune hacia regiones más conservadas del virus tales como el ectodominio de la proteína M2 (M2e), con el fin de generar vacunas universales. Sin embargo, y a pesar de que M2e está conservada, con baja frecuencia se han reportado algunas mutaciones que podría poner en riesgo la efectividad de dichas vacunas. El objetivo del proyecto es generar virus de influenza A con M2e modificados con el fin de determinar el fitness y el potencial de escape de dichos virus a la respuesta inmune inducida por vacunas universales. Como paso inicial se comenzó con la introducción de mutaciones puntuales en M2e utilizando un vector para genética reversa que codifica la proteína M2 en el mismo fragmento que la proteína NA. Se utilizó también un segundo vector que expresa la proteína M1 y tienen deleteados los sitios de splicing alternativo que conducen a la expresión de M2. Utilizando la técnica de mutagénesis dirigida se introdujeron mutaciones en M2e por PCR seguida por restricción con la enzima DpnI y posterior transformación en bacterias DH5alfa. Los clones positivos se analizaron por restricción con la enzima XbaI. Para poner a punto la técnica de genética reversa, que permite la generación de virus infectivo, se co-transfectaron células HEK-293 con estos vectores y otros 6 vectores que codifican para el resto de las proteínas del virus. A las 24-48 horas postransfección, se utilizó el sobrenadante de las células transfectadas para infectar células MDCK y se determinó la formación de partículas infectivas por observación de la destrucción de la monocapa de células. Las construcciones también fueron analizadas mediante Western Blot para determinar la correcta expresión de las proteínas M1 y M2. A partir de los resultados obtenidos hasta el momento, podemos concluir que es posible la modificación del virus de influenza mediante las estrategias planteadas. Esto nos permitirá generar virus mutantes para determinar la capacidad protectiva de vacunas universales basadas en M2e.