REGULACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ARENAVIRUS TACARIBE POR LA PROTEÍNA KINASA C (PKC)

LOPEZ, N; FOSACALDI, S; D'ANTUONO, A; REY, O

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

La actividad de kinasas celulares ha sido implicada en la multiplicaciónde virus pertenecientes a diversas familias, incluyendo Arenaviridae.El virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo,es un modelo ampliamente utilizado para estudiar los mecanismosmoleculares que median la replicación de esta familia de virus. Por lotanto, examinamos el efecto de un panel de inhibidores específicospara las proteína-kinasas PKCs, PKDs, PKA y AKT sobre la replicaciónviral empleando un sistema minireplicón. Este se basa en lacoexpresión de un minigenoma (análogo al segmento genómico S deTCRV) que codifica para el gen reportero Luciferasa de Firefly (LUC),junto con las dos proteínas virales requeridas para sostener latranscripción y replicación del genoma viral, la Nucleoproteína (NP) yla polimerasa (L). Células BSR fueron preincubadas con los inhibidoresy luego transfectadas con los plásmidos que expresan loscomponentes del sistema, además de un plásmido control que expresaLuciferasa de Renilla (REN). Luego de una incubación por 24 hs enpresencia de los inhibidores, se procedió a la determinación de laactividad de LUC y REN en los lisados celulares. Los resultadosrevelaron que la incubación con el inhibidor Go6983 (2,5 µM final), queinhibe un amplio espectro de PKCs, como con GF109203X (3,5 µM) oGo6976 (1µM), que inhiben selectivamente las isoformas α y β de PKC,causó un aumento de 60 a 90% en la replicación del minigenomarespecto al control. El efecto no fue observado cuando se utilizaroninhibidores de PKD, Akt o PKA. A fin de obtener evidencia adicional,células Vero fueron preincubadas durante 3 horas con cada uno de losinhibidores de PKC (GF109203X, Go6983 o Go6976), y luego infectadascon TCRV a una multiplicidad de infección de 0,1-3 PFU/ml. Luego deuna incubación por 48 hs en presencia de los inhibidores, el virusliberado a los sobrenadantes celulares fue cuantificado mediantetitulación en un ensayo de placas, y el nivel intracelular de ARN viralfue determinado mediante RT-qPCR. Además, la presencia de NP enlos lisados de células tratadas en paralelo fue analizada medianteWestern Blot. Los resultados indicaron que la incubación de las célulascon los inhibidores de PKC causó un incremento en la producción devirus infectivos respecto al control. En forma concordante, los nivelesde ARN viral en las células incubadas con los inhibidores fueron 6 a 12veces mayores que los detectados en el control y se observó ademásun aumento relativo en la acumulación de NP intracelular en loscorrespondientes lisados celulares. Estos datos confirmaron lasobservaciones obtenidas en el contexto del sistema de genéticareversa, apoyando la hipótesis que PKC, o una vía de señalizacióndependiente de esta kinasa, regula la actividad del complejopolimerasa (NP+L) durante la replicación viral.