OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE NS1 DE LOS CUATRO SEROTIPOS DEL VIRUS DEL DENGUE Y SU UTILIZACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

BERGMANN I.E.; MALNERO, C.M; IBAÑEZ, I; MALIRAT V; PAREDES ROJAS, J

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; V Simposio de Virología Clínica III; Simposio de Virología Veterinaria; 2017

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue (DENV), del cual se conocen 4 serotipos, causa unaenfermedad que constituye un problema importante de salud pública.En Argentina la mayor epidemia se produjo en el año 2016, con más de40.000 casos confirmados. El diagnóstico se basa en la utilización de kitscomerciales importados, los cuales presentan además de un costoelevado, una proporción de reactividad cruzada con otros flavivirus.Teniendo en cuenta el impacto socio-económico que tiene laenfermedad tanto en nuestro país como en la región, es de gran interésdesarrollar métodos de diagnóstico y prevención eficaces.El objetivo de este trabajo es la obtención de antígenos recombinantesderivados de la proteína NS1 del DENV y su aplicación para la obtenciónde anticuerpos monoclonales específicos.Las regiones correspondientes a la NS1 de los cuatro serotipos, fueronclonadas en el vector de expresión pET28a conteniendo un tag dehistidina. La proteína recombinante (rNS1) fue expresadas en la cepa deE. Coli Rossetta-gami 2 pLyss y purificada por solubilización diferencialcon urea a partir de cuerpos de inclusión seguida de cromatografía deafinidad (IMAC) con columna HisTrap HP. Su identidad se confirmómediante Western Blot utilizando anticuerpo anti-histidina y suerospoliclonales de ratones inmunizados con sobrenadante de infección.Para la obtención de los anticuerpos monoclonales se realizaroninmunizaciones de ratones cada 21 días, con el siguiente esquema: dosinmunizaciones con rNS1, la 1° por vía intraperitoneal (serotipos 3 y 4) yla 2° por vía subcutánea (serotipos 1 y 2). Una 3° inmunización fuerealizada con una proteína NS1 comercial por vía intraperitoneal. El títulode anticuerpos de los ratones, analizado por ELISA, fue satisfactorio,procediéndose a la administración de un boost por vía intraperitonealcon una mezcla de todos los antígenos. Cuatro días luego de la últimainmunización se extrajeron los esplenocitos del bazo y se fusionaron concélulas SP2/O-Ag14 mediante la adición de PEG 1500. Se realizó laselección de los hibridomas viables suplementando HAT al medio decultivo.Hibridomas secretores de anticuerpos específicos fueron identificadosmediante ELISA directo utilizando como antígeno las rNS1 purificadas. Lamayoría de los hibridomas obtenidos expresaron anticuerpos quemostraban reactividad contra la rNS1 de los cuatro serotipos. Asimismolos hibridomas fueron analizados sensibilizando placas de ELISA consobrenadante de infección, para evaluar la reactividad contra la proteínaen su conformación nativa. Los resultados obtenidos nos permitieronseleccionar 11 clones, de los cuales 6 fueron elegidos en primerainstancia para sub-clonar y caracterizar.En conclusión, se obtuvieron antígenos recombinantes derivados de laproteína NS1 de los cuatro serotipos del DENV en un sistema procariota,los cuales fueron utilizados para la producción y selección de anticuerposmonoclonales con potencial aplicación en diagnóstico y/o investigación.