Obtención de un antígeno recombinante derivado de la proteína NS1 del Virus del Dengue Serotipo 3 en E. Coli, con potencial aplicación en diagnóstico.

RIPPETTA, MS; BERGMANN I.E; MALNERO, C; IBAÑEZ, I; PAREDES, Y; MALIRAT V

Rosario

Congreso; XXII Congreso Latinoamericano de Microbiologìa y XIV Congreso Argentino de Microbiologìa; 2016

Sociedad Argentina de Microbiologia

El virus Dengue (DENV), arbovirus de la familia Flaviviridae, con cuatro serotipos identificados, es el agente causal de la fiebre Dengue. En Argentina esta enfermedad se presenta como epidemias, resultando la del año en curso la peor en la historia del país. Hasta la semana 17, el Ministerio de Salud informó 34.992 casos confirmados y/o probables. Se trata de una situación preocupante ya que no se cuenta con vacunas ni terapias antivirales eficaces. La mejor forma de controlar la enfermedad es el control del vector y el diagnóstico rápido y preciso de los casos clínicos. Si bien existen disponibles kits comerciales para la detección de proteínas virales y anticuerpos contra el virus en suero de pacientes, se han informado problemas de reactividad cruzada con otros virus, principalmente flavivirus. Estos kits son importados y se comercializan a precios elevados.El objetivo de este trabajo es evaluar la capacidad de un antígeno recombinante, derivado de la región que codifica para la proteína NS1 del DENV y expresado en un sistema procariota, de ser usado en diagnóstico y eventualmente para investigación viral básica.La metodología empleada incluyó: infección viral en células Vero con el DENV-3 y extracción de ARN del sobrenadante. Luego se amplificó por RT-PCR una región del genoma viral que contiene la secuencia codificante de la proteína NS1 con iniciadores diseñados para tal fin. Los amplicones obtenidos se clonaron en el vector de expresión pET28a que contiene un tag de histidinas. La expresión de la proteína recombinante, rNS1-D3, se realizó por inducción con IPTG en diferentes condiciones, visualizándose los resultados mediante SDS-PAGE y Western blot utilizando un anticuerpo primario anti-histidina. Los métodos de purificación probados incluyeron solubilización con urea, seguido de electroelución o de afinidad con resina de cobalto. Concomitantemente se inmunizaron ratones Balb/c con virus inactivado siguiendo el siguiente esquema: primera inmunización con DENV-4 y dos re-inmunizaciones sucesivas con DENV-2 y DENV-1+3. La capacidad antigénica de la rNS1-D3, se evaluó mediante un Western blot empleando como anticuerpo primario sueros de ratones referidos anteriormente.Los resultados obtenidos mostraron buena expresión de rNS1-D3 en la cepa Rosetta Gami 2 pLyss a 37°C, con niveles similares cuando se probaron los medios Luria, Terrific y Estándar 1. La proteína se obtuvo en la fracción precipitable del lisado bacteriano y se logró su purificación con buena eficiencia de recuperación. La rNS1-D3 producida en este sistema mostró reactividad contra los anticuerpos de ratones inmunizados con DENV inactivado.En conclusión, fue posible clonar y expresar un antígeno recombinante derivado de la proteína NS1 del DENV-3, con buenos niveles de producción, que se muestra prometedor para el desarrollo de kits de diagnóstico del virus del dengue, a costos de producción competitivos, y adicionalmente puede ser empleado para trabajos de investigación.