Desarrollo de un kit de diagnóstico de dengue basad en nanoanticuerpos.

ROJAS Y.; GARCÍA C.; MALNERO C.; CALDEVILLA C.; MATTION N.; IBAÑEZ LI.

Buenos Aires

Simposio; IV Simposio Internacional de Virología Clínica y Avances en Vacunas; 2016

Sociedad Panamericana de Virología Clínica

El Dengue es una enfermedad viral transmitida por mosquitos que se ha vuelto endémica en Argentina. En el suero de pacientes infectados es posible detectar la proteína viral NS1, lo que ha permitido el desarrollo de kits diagnóstico de la enfermedad. Los Nanoanticuerpos (NanoAcs) son fragmentos de anticuerpos de cadena pesada obtenidos desde camélidos que representan una potencial herramienta para la detección de proteínas del Dengue. Son pequeñas moléculas de gran afinidad y especificidad, termoestables, que se pueden expresar a bajo costo en microorganismos y se pueden modificar fácilmente por técnicas estándar de biología molecular. Teniendo en cuenta la necesidad de contar con sistemas de detección innovadores y de menor costo que los actuales, en este trabajo reportamos la obtención y caracterización de NanoAcs con capacidad de reconocer la proteína NS1 del virus Dengue.Se inmunizaron dos llamas con sobrenadante purificado e inactivado de células infectadas con Dengue que contenía altos niveles de NS1. Una vez alcanzada una respuesta inmune adecuada, se extrajo ARN de linfocitos. Se preparó ADNc y se amplificaron las regiones codificantes del fragmento variable de la cadena pesada mediante PCR, para luego ser clonados en el vector fagémido pHEN4. Este plásmido fue transformado en bacterias TG1 que fueron posteriormente infectadas con un fago helper. Los NanoAcs candidatos se seleccionaron por biopanning en fase sólida usando la proteína NS1 recombinante, y posteriormente se purificaron del periplasma bacteriano. Los clones candidatos se analizaron por ELISA y su variabilidad se determinó por PCR de colonias individuales seguida de digestión enzimática.Se obtuvieron dos bibliotecas de aproximadamente 2x108 transformantes que poseían al menos un 88% de insertos de tamaño correcto. Luego de 3 rondas de biopanning utilizando diferentes métodos de elución, se aislaron 192 clones que fueron analizados por ELISA. Se pudo determinar que los NanoAcs producidos reconocen de manera específica a la proteína NS1. Se espera poder modificar y expresar a gran escala los clones seleccionados para poder en un futuro cercado, generar un kit diagnóstico que permita la detección temprana de la infección por virus de Dengue.