Cultivo in vitro de células de tabaco que expresan una versión truncada de la glicoproteína E2, principal inmunógeno del Virus de la Diarrea Viral bovina

GUILLERMO NELSON; PATRICIA MARCONI; MELINA LAGUÍA BECHER; VALERIA RICCO; MARÍA A. ALVAREZ

Asunción

Congreso; XV Simposio Latinoamericano de Farmacobotánica I Congreso Paraguayo de Farmacobotánica; 2015

Introducción: la glicoproteína E2es la principal proteína inmunogénica del virus de la diarrea viral bovina (VDVB). Se han desarrollado varias plataformas para su producción (células bacterianas, levaduras, células de insectos) entre las que se encuentra la vegetal por su maquinaria de síntesis proteica capaz de realizar la mayoría de las modificaciones post-traducción típicas de células animales. Objetivo: expresar el gen de la glicoproteína E2 truncada del VDVB en Nicotiana tabacum. Materiales y métodos: se realizó la expresión transitoria en hojas de tabaco y la expresión estable en cultivos in vitro iniciados a partir hojas agroinfiltradas en medio Murashige & Skoog con el agregado de agar (8 %), sacarosa (30 g l-1) y como reguladores de crecimiento ácido naftalenacético y kinetina (10:1). Los callos fueron utilizados como inóculo para iniciar suspensiones celulares en Erlenmeyers de 250 ml y luego se escaló a un bioreactor Minifors (Infors) de 2 l con un inóculo inicial del 10 % V/V y 10 días de edad. Se estudió la cinética de crecimiento y de expresión de E2. Se formularon dos vacunas experimentales utilizando extractos de N. tabacum que expresan la proteína E2 (20 g ml-1) y un adyuvante acuoso (hidróxido de aluminio) u oleoso (Montanide ISA 70 SEPPIC). Se realizaron ensayos de neutralización viral y cuantificación de anticuerpos neutralizantes por ELISA en cobayos (Res SENASA 589/12). Luego se realizó el ensayo en ganado bovino, con vacunación a tiempo 0 y a los 15 días, realizándose sangrías los 0, 15 y 30 días.Resultados: se confirmó la expresión de E2 recombinante por Western blot obteniéndose una banda que se corresponde con el peso molecular de dímero (75 kDa) y por ELISA obteniéndose niveles de expresión de 20 g g-1 de peso seco. En bioreactor la velocidad específica de crecimiento máxima fue de 2.4 d-1 con un tiempo de duplicación de 0.32 días, y un rendimiento de 10 g E2r / mg para la versión de retención en retículo. En cobayos se observó presencia de anticuerpos específicos neutralizantes y en bovinos se observó seroconversión en 87.5% de los animales a los 30 días.