Construcción de bibliotecas de anticuerpos de dominio único derivados de camélidos (VHH o nanoanticuerpos) y obtención de anticuerpos contra la cepa A24/Cruzeiro del virus de la fiebre aftosa

GRIPPO VANINA; DE NICOLA JEANETTE; BOZZO JOAQUIN; MATTION, NORA

Buenos Aires

Congreso; XI CONGRESO ARGENTINO DE VIROLOGIA-II CONGRESO LATINOAMERICANO DE VIROLOGIA; 2015

AAM

. Introducción. La Fiebre Aftosa plantea necesidades importantes no satisfechas que exigen enfoques innovadores. Debido a sus propiedades únicas en comparación con los anticuerpos convencionales, los Nano-anticuerpos o VHH han revolucionado el campo de los anticuerpos monoclonales y presentan un gran potencial en el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos más sensibles y específicos. Esto se debe a que los VHHs permiten fijar una mayor densidad de anticuerpos incrementando la sensibilidad en el diagnóstico al detectar concentraciones significativamente menores de un antígeno. Por esta razón, el presente trabajo tiene como objetivo obtener y producir Nano-anticuerpos contra la cepa A24/CRUZEIRO del virus de la Fiebre Aftosa para ser utilizados en la innovación y mejora del diagnóstico de esta infección viral. Metodología y resultados. Para lograr tal objetivo, dos llamas (Lama glama) fueron inmunizadas 3 veces cada 2 semanas con la cepa A24/CRUZEIRO (SENASA). Se comprobó la inducción de una alta respuesta inmune por ELISA en fase líquida, el título fue menor a 1.10 para el suero pre-inmune y alcanzó después de las inmunizaciones un valor de 3.70 y 4.55 para la llama S y B, respectivamente. A partir de la sangre total periférica de estas llamas inmunizadas, se preparó ARN total y se sintetizó el ADNc. En una primera PCR, se amplificaron las regiones variables de cadenas pesadas tanto de anticuerpos convencionales (VH, producto de 900bp) como de anticuerpos de cadena única (VHH, producto de 700bp). En una segunda PCR, se amplificó solo el repertorio de VHH (400bp) y se introdujeron los sitios de restricción para su posterior clonado. Los fragmentos VHH fueron clonados en el vector pHEN4 y tales construcciones se electroporaron en la cepa E. coli TG1 obteniéndose 2 bibliotecas inmunes de Nano-anticuerpos. En ambos casos, su tamaño fue mayor a 107 ufc/ug y el porcentaje de clones con inserto completo determinado por ?colony-PCR? fue superior a 92%. Luego, se procedió al rastreo de las bibliotecas aprovechando la afinidad de los fagos que expresan los VHH por la cepa A24/CRUZEIRO. Después de la segunda ronda de selección, se obtuvieron fagos expresando en su superficie los VHHs que reconocieron a la cepa en ELISA de fagos policlonal y monoclonal. La diversidad de los clones fue analizada por digestión enzimática con HinfI y posterior secuenciación. Luego, se indujo la expresión de los VHHs en forma soluble a partir de los clones seleccionados y se confirmó la reactividad específica de los anticuerpos solubles contra la cepa A24/CRUZEIRO por ELISA en fase líquida. Conclusiones. Este trabajo presenta la primera obtención y caracterización de Nano-anticuerpos contra la cepa A24/CRUZEIRO del virus de la Fiebre Aftosa, lo cual constituye una herramienta innovadora como base para el desarrollo y mejora del diagnóstico de esta infección viral.